BMRI 生物医学研究的国际 2314 - 6141 2314 - 6133 Hindawi 10.1155 / 2020/9549765 9549765 研究文章 RNAi技术干扰的使用 Zfx基因会增加马鹿的男性自杀率( Cervus elaphus)的后代 https://orcid.org/0000 - 0002 - 6369 - 1545 魏 港 1 2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 7054 - 7544 习 杰出的 1 张 永胜 1 https://orcid.org/0000 - 0001 - 7482 - 7340 曾 薄 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 6511 - 6245 李 冯 2 3 https://orcid.org/0000 - 0001 - 5039 - 2098 王 凯盛 4 https://orcid.org/0000 - 0002 - 1307 - 2869 张 本 2 https://orcid.org/0000 - 0001 - 9961 - 8238 赵 西塘 5 https://orcid.org/0000 - 0001 - 5479 - 9119 李 应 2 https://orcid.org/0000 - 0002 - 3293 - 0822 沈 在香港 1 https://orcid.org/0000 - 0003 - 3751 - 7321 江 首歌 1 https://orcid.org/0000 - 0003 - 3776 - 4971 贾 本 1 举行 格言 1 动物科学与技术学院 石河子大学 832003年石河子 中国 shzu.edu.cn 2 农业动物遗传资源勘探和创新四川省重点实验室 四川农业大学 成都 四川611130 中国 sicau.edu.cn 3 中国西南野生动物资源保护重点实验室(教育部) 中国西部师范大学 南充 四川637002 中国 cwnu.edu.cn 4 学院的生物学和药店 玉林师范大学 玉林 广西537000年 中国 ylu.edu.cn 5 新疆生产建设兵团乙级联赛34 Kuerle 新疆841000年 中国 2020年 19 5 2020年 2020年 12 01 2020年 26 04 2020年 02 05年 2020年 19 5 2020年 2020年 版权©2020港魏et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

锌指蛋白x连锁( Zfx)被认为是一个性别决定因素,在精子发生中起着至关重要的作用。RNAi的沉默是一种有效的方法 Zfx信使rna表达。然而,很少有研究利用RNAi技术控制马鹿的后代的性别( Cervus elaphus)。本研究的目的是首先探索一种有效的方法来改变马鹿后代性别比例通过沉默基因 Zfx在精子形成。三个重组表达载体pLL3.7 / pLL3.7 / B, pLL3.7 / C中断 Zfx基因。结果表明,的表达 Zfx信使rna明显被pLL3.7 / ( P < 0.01 ),与对照组相比。组注射pLL3.7 /生产了94红鹿,其中包括68名男性和26名女性。雄性率(72.34%)明显高于对照组( P < 0.01 )。我们的结果表明, Zfx核是一种有用的方法来控制后代性别在马鹿。本研究进一步证实 Zfx基因在X精子形成的过程中起着重要作用。

 石河子大学 RCZK2018C13 1。背景

红鹿( Cervus elaphus)是二等保护动物在中国和一个重要的经济动物。它有一个高输出的鹿角和巨大的经济价值。鹿茸是一种珍贵的中药和有价值的营养健康产品( 1, 2]。鹿茸是有多种药理活性,如免疫调节、愈合效果,抗炎和增强性功能的 2- - - - - - 4]。提高马鹿的主要目的是获取鹿角,只有男性产生鹿角,所以生产者有兴趣获得更多雄性幼鹿马鹿养殖的经济效益。因此,急需一种技术在未来控制马鹿和改善男性的性别比率,这是一个重要手段增加鹿角的生产,提高经济效益。

二倍体脊椎动物的后代的性别取决于父本的性染色体( 5]。X和Y之间的斗争单倍体精子的存在不仅在睾丸(卵巢还 6]。大多数当前工作的重点在性别决定隔离X和Y精子根据物理参数,如密度、游泳速度、表面电荷、性别抗原。到目前为止,流式细胞仪(FCM)分析精子分离,最准确的方法,精度可以达到90% 7]。虽然成功使用精子可以实现排序,它非常昂贵,超出了大多数的专业生产设备。我们假设控制X和Y精子的至关重要的特定的信使rna可能是一个有效的方法来确定性别的动物以较低的成本。

Zfx和 Zfy被认为扮演了重要的角色在性别决定精子发生( 8- - - - - - 11]。锌指蛋白图案的绑定核酸结合蛋白起着重要的作用在早期胚胎的性别鉴定 12, 13]。比较的放大模式 Zfx/ Zfy基因是一个简单和准确的方法对动物性别鉴定,目前已广泛应用( 14- - - - - - 16]。的长篇 Zfx蛋白质X染色体上编码,并包含一个核本地化序列(NLS),酸性转录激活域(广告)和dna结合域(DBD)组成的13 C2H2-type锌手指( 17]。 Zfx关心的是X精子形成,这可以作为一个强大的转录激活因子,和指导目标基因定位在X精子细胞核核膜[ 18]。张先生和他的同事们发现[19] Zfx在X精子的过程中发挥了重要作用的发展。沉默的表达 Zfx可能会干扰这些性别基因在减数分裂我的正常功能( 19]。

RNAi基因沉默是一种有效的方法,它能有效地使目标基因失去功能( 20.- - - - - - 22]。使用RNAi沉默的表达 Zfx信使rna来限制或恶化单倍体精子X是一种有效的发展方式向男性倾斜后代的性别比例( 19]。然而,几乎没有研究使用RNAi技术控制马鹿的后代的性别。因此,在这项研究中,特定的RNA干扰片段最初旨在干扰X精子的发展,为了改变马鹿的后代的男性比例,提高红鹿产业的市场经济效益。

 2。材料和方法 2.1。实验动物

选择健康的马鹿新疆生产建设兵团第二师的34岁including16鹿和216。其中,我们随机选择108雄鹿和作为一个实验组和对照组。所有实验动物都是在同样的条件下。综述了在这个实验中使用的所有程序和批准的动物保健和使用委员会石河子大学。马鹿保健和使用进行了严格按照石河子大学动物研究委员会的指导方针。执行所有睾丸切除术手术麻醉4毫升甲苯噻嗪盐酸注入(100毫克/毫升)(青岛Hanhe动植物医药有限公司,产品编号171225)每鹿和复苏8毫升尼可刹米注射液(250毫克/毫升)(青岛Hanhe动植物医药有限公司,产品编号171106)每鹿根据制造商的指示,和所有正在努力减少痛苦。本研究注射质粒并没有导致任何动物的健康影响。注射后,动物们回到他们的标准住房。

 2.2。建设PLL3.7-shZfx复合向量

Zfx马鹿siRNA序列进行评估和选择 Zfx序列(KP257294.1)和核设计原则( 23, 24]。根据核的设计原则,初步筛选的小干扰rna序列处理设计,然后小干扰rna序列的选择和比较马鹿的同源性 Zfy通过爆炸序列(MN560153)。非特异性片段被消除,3小干扰rna序列终于选定特定的(表 1)。限制性内切酶( 高致病性禽流感和 XhoI)被添加到5 ′ 和3 ′ 小干扰rna序列的结束。感和反义链寡核苷酸序列(表 2退火。退火产品连接到pentilox 3.7 (pLL3.7)减少 高致病性禽流感和 XhoI(豆类、生物技术有限公司、大连、中国)。慢病毒传递向量pLentiLox3.7 (pLL3.7)包含鼠标U6 RNA聚合酶III启动子( 1]。此外, 高致病性禽流感和 XhoI限制性内切酶、细菌抵抗氨苄青霉素和可选择的GFP标记被发现的矢量,这是方便的抗性筛选转化或转染阳性细胞。核重组表达载体被命名为pLL3.7 /, pLL3.7 / B和pLL3.7 / C,然后转换成大肠杆菌dh5 α活跃的细胞(Tiangen生物技术有限公司、北京、中国)。从细菌中提取质粒的解决方案使用TIANprep迷你质粒工具包(Tiangen生物技术有限公司、北京、中国)和存储在-20°C。

Zfx互补脱氧核糖核酸模板siRNA体外转录。

Zfx (KP257294.1)
一个 GTGAGGACTACCTTATGAT
B GACGTCTTAGCTTCTGATA
C GAAGCAGATGTATCTGAAA

ZfxRNAi寡核苷酸序列 高致病性禽流感和 XhoI酶的网站。

向量成分 寡核苷酸序列
pLL3.7一 F: 5 ′ -TGTGAGGACTACCTTATGATTTCAAGAGAATCATAAGGTAGTCCTCACTTTTTTC-3 ′
R: 5 ′ -TCGAGAAAAAAGTGAGGACTACCTTATGATTCTCTTGAAATCATAAGGTAGTCCTCACA-3 ′
pLL3.7 B F: 5 ′ -TGACGTCTTAGCTTCTGATATTCAAGAGATATCAGAAGCTAAGACGTCTTTTTTC-3 ′
R: 5 ′ -TCGAGAAAAAAGACGTCTTAGCTTCTGATATCTCTTGAATATCAGAAGCTAAGACGTCA-3 ′
pLL3.7 C F: 5 ′ -TGAAGCAGATGTATCTGAAATTCAAGAGATTTCAGATACATCTGCTTCTTTTTTC-3 ′
R: 5 ′ -TCGAGAAAAAAGAAGCAGATGTATCTGAAATCTCTTGAATTTCAGATACATCTGCTTCA-3 ′

注:使用pLL3.7作为向量建设成分干扰片段。

 3所示。< /斜体> <斜体> Zfx基因RNAi体外实验 3.1。隔离和生殖细胞的文化

改进的两步酶消化法分离红鹿睾丸的生殖细胞( 25]。精子发生的细胞与支持细胞体外cocultured有限公司2孵化器( 26, 27]。6-well细胞培养的细胞培养板、和每个包含 3 × 10 5 - - - - - - 6 × 10 5 生殖细胞在孵化器37°C的温度,5%的股份有限公司2,95%的相对湿度。

 3.2。转染的<斜体> Zfx < /斜体> RNAi向量和存在的分析

培养24小时后,重构向量被转染到培养细胞使用Lipofectamine 3000(美国表达载体)。营养液是改变,观察细胞在培养期间Lipofectamine 3000每24小时。在这个实验中,荧光蛋白的表达是由荧光倒置显微镜观察转染后24 h, 48 h, 58 h和72 h。转染效率最高的细胞RNA被Tiangen提取总RNA提取试剂,然后reverse-transcribed到互补脱氧核糖核酸RT试剂盒(豆类)。

 3.3。每个向量体外的RNAi效率

的mRNA水平 Zfx和 Gapdh(表 3)是由RT-qPCR (LightCycler2.0,罗氏、巴塞尔、瑞士)。RT-qPCR反应系统包含10 μL SYBR@预混料TAqTM交货(2×),0.4 μL寡核苷酸引物2 μL模板,和无菌蒸馏水20 μl .和项目如下:最初的变性步骤(30年代在95°C), 40 95°C的周期10年代,60°C 30年代,30年代的72°C。每个样品重复三次提高精确度。

PCR和寡核苷酸引物对条件。

目标 基因 基因库 序列的引物(5 ′ →3 ′ ) 退火温度 产品(bp)
Zfx KP257294.1 F: TATGGATTCACTCGTCAA 60°C 120年
接待员:CTCAGATGTAACAGAAGAAG
GAPDH AY650282.1 F: AAGGCCATCACCATCTTCCA 60°C 80年
接待员:CCAGCATCACCCCACTTGA
4所示。< /斜体> <斜体> Zfx基因RNAi体内实验 4.1。的质粒注射马鹿的睾丸

睾丸注射技术是一个重要的动物基因工程和胚胎工程的技术手段。睾丸注入包括三种方法:网睾丸注入,精小管注射,注射和睾丸间质,网睾丸注射能有效地获得积极的后代携带目标基因( 28]。我们实验室成功应用睾丸注射结合RNAi干扰技术来显著改变后代的性别 19, 29日- - - - - - 31日]。在这项研究中,红鹿注入网睾丸后通过一个注射器纵轴与甲苯噻嗪盐酸盐全身麻醉。在实验组中,重组质粒表达载体包含Penicillin-Streptomycin与PBS稀释,然后注入8鹿的睾丸在3毫克鹿在每个睾丸(1.5毫克),4次10天。第四注射3天后,8鹿被随机投入8女育种附件(9 - 15在每个繁殖附件)自然交配。而没有注射的对照组正常鹿RNAi向量。在整个实验中,所有的条件都是一样的。

 4.2。统计分析

数据通过SPSS 20.0统计分析(IBM公司)。分析的定量结果 Gapdh表达式作为内部标准和双重标准曲线。mrna的表达差异计算方程 2 Δ Δ Ct ,在那里 Δ Ct = Ct Z f x − Ct ( Gapdh), Δ Δ Ct = Δ Ct Z f x Δ Ct (控制)。mRNA水平差异的显著差异是由单向方差分析量化(LSD)。的意义区别男性和女性的比例的后代是评估使用 χ 2 测试。数据由GraphPad棱镜8.0.1。

 5。结果与讨论 5.1。结果 5.1.1。生殖细胞分离和转染

第四胶原酶、透明质酸酶和胰蛋白酶是用来消化马鹿的睾丸组织生殖细胞和支持细胞;种族隔离的生殖细胞是圆和完整与清晰的轮廓和形状统一大小。然而,孤立的塞尔托利氏细胞不规则;他们中的大多数是多边形和三角形(图 1)。培养24小时后,重构向量被转染进培养细胞。没有荧光表达在转染后24小时;然而,有一些荧光表达在48 h, h和最高的荧光表达在58;此外,转染效率可达到90%左右。然而,72 h,细胞的生存能力下降,一些细胞凋亡。58 h,转染后细胞信使rna提取,然后reverse-transcribed互补。结果在58 h表明转染 Zfx基因RNAi向量被成功转移到红鹿的生殖细胞(图 2)。

马鹿生殖细胞的分离。生殖细胞圆形,完整与清晰的轮廓和形状统一的大小,和孤立的塞尔托利氏细胞不规则;他们中的大多数是多边形和三角形。倒置荧光显微镜下观察细胞(LeicaDMi8徕卡微系统公司,位于德国)。酒吧代表100 μm。

转染干扰向量48 h和58 h的生殖细胞。 Zfx基因RNAi向量转换成红鹿生殖细胞,转染生殖细胞和荧光标签。(一)有一些荧光表达在48 h。(b)荧光表达是58小时最高的。倒置荧光显微镜下观察细胞(LeicaDMi8徕卡微系统公司,位于德国)。酒吧代表100 μm。

 6。<斜体>的表达Zfx < /斜体> mRNA在注射组和对照组中存在

的 ZfxmRNA水平的研究结果表明,复合向量都低于对照组,空白和vector-free组织(图 3)。具体来说, Zfx信使rna水平的测试组注射pLL3.7 / ( P < 0.01 )明显低于对照组和转染pLL3.7 / B比对照组低( P < 0.05 )。因此,本文选取pLL3.7 /一个向量在体内实验中使用,因为它的表达式 Zfx信使rna ( P < 0.01 )。

信使rna表达水平的 Zfx。 Zfx对的mRNA表达规范化 Gapdh与对照组的表达。数据是 的意思是 ± sd 。 ∗ P < 0.05 和 ∗ ∗ P < 0.01 相比之下,控制。

 7所示。统计分析性别比例的后代

红鹿的妊娠期 246年 ± 7 天,1垃圾/胎儿。noninjection组作为对照组,生产了98红鹿,包括50名男性和48个雌性,而组注射pLL3.7 /生产了94红鹿,其中包括68名男性和26名女性。雄性率(72.34%)明显高于对照组( P < 0.01 )(表 4)。

女性和男性后代的数量每组的红鹿。

子群 受胎率 繁殖成功率 死胎率 后代出生体重 女 男性 男性率
Noninjection 100/108 1 2/100 10.65公斤 48 50 51.02%
注射 97/108 1 3/97 10.73公斤 26 68年 72.34% ∗ ∗

这个结果表明 Zfx基因中扮演一个重要的角色在X精子形成的过程。 Zfx核是一种先进的方法来控制马鹿X精子发生和后代的性别比例。

受胎率意味着没有。怀孕/不。所有的女性;生殖率意味着垃圾每怀孕;死胎率意味着没有。死产的胎儿/不。的妊娠。 ∗ ∗ 意味着极其noninjection组和治疗组之间的显著差异( P < 0.01 )。

 8。讨论

尽管性别决定机制的繁殖需要多个基因相互作用,自然的性别比例稳定在1:1 ( 32]。X或Y精子的形成精子形成过程中扮演重要的角色在性别决定后代的 33]。先前的研究发现,在我们的实验室 Zfx和 Zfy核可以改变动物的后代的性别比例,如牛、鼠,羊( 19, 30., 31日]。红鹿是一种特殊的经济动物,其鹿角大市场经济价值。然而,几乎没有研究使用RNAi技术控制马鹿的后代的性别。在我们的研究中,红鹿 ZfxsiRNA最初旨在改变后代的性别比例,再次展示的重要作用 Zfx在性别。更重要的是,它具有重要意义增加男性后代马鹿鹿茸产量增加的比例和经济效益。

目前,只有一个小研究 Zfx基因沉默,使后代的性转变,所以的作用机制 Zfx在精子还不清楚。一些研究表明,降低的程度 Zfx/ ZfymRNA表达会使生理功能的X / Y精子更糟的是,会影响后代的性别( 19, 29日- - - - - - 31日, 34]。 Zfy控制精子头部和尾部形成和颈部发展( 35),这是减数分裂我和减数分裂二世之间高度表达。它可以调节精子形态和ROSI效率和促进第二次减数分裂( 36, 37]。同样的, Zfx基因是一级的减数分裂后我总是表达了在精子发生( 18]。的高表达 Zfx在圆形精子细胞的成年小鼠睾丸精母细胞的自我更新的控制。一般来说, Zfy基因是确保发生第二次减数分裂,大户和基因 Zfx在染色体有促进作用 38]。减少的表达水平 Zfx信使rna将影响单倍体精子X的发展,这将导致减少雌性后代的 19]。

然而,没有健康异常和实验动物组的繁殖性能下降,而对照组动物组。然后,雄性红鹿被安置在雌性繁殖围场自然交配10-40日内第四注入的向量。这是符合羊的精子发生的周期和精子发生的波 39)中, Zfx同源性是接近红色的鹿。根据我们实验室的经验,四个注射干扰片段通常会产生的影响45天,超过45天没有效果,注射后10 ~ 30天是最好的匹配时间。此外,生育率、难产率、流产率、繁殖率、空胚胎率,后代存活率,后代畸形率的母鹿实验组与对照组相比没有异常。总之,在相同饲养条件下,与正常对照组相比,实验组的后代的性别比例发生了巨大的变化,和男性的比例达到72.34%。它表明,注入干扰片段改变后代的性别比例没有影响动物的生理功能和生殖性能。然而,雄鹿的增加,似乎这也可能会导致一些生产问题很长一段时间;例如,少母鹿也会导致更少的后代。但是母鹿的数量在我们的农场是足够大,所以它不会影响后代,因为注入。此外,一般来说,屏幕和保留足够的母鹿鹿农场每年繁殖能力很强,所以它不会因为性控制减少后代的数量。因此,沉默的 Zfx性为未来的应用程序是安全的和有效的控制。

精子发生是一个受到高度监管有序的过程。它是由许多基因,但其机制尚不清楚 40, 41),这还需要进一步的研究。然而,这项研究中, Zfx基因沉默技术已成功用于大大增加男性马鹿的后代的数量,这不仅增加了生产的经济效益,也为后续研究提供了理论参考性别控制机制科学研究。

 9。结论

这项研究的结果表明,使用RNAi中断 Zfx是一个有用的方法来控制马鹿性,进一步确认了吗 Zfx基因在X精子形成的过程中起着重要作用。

 数据可用性

马鹿 Zfx序列和马鹿 Zfy序列,分别存档在NCBI基因库加入数字KP257294.1和MN560153。

 信息披露

资助机构没有输入的设计研究或在收集、分析、解释数据。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

江港魏和歌曲同样这项工作做出了贡献。

 确认

提供的资金是一个高层次人才科研启动基金项目支持新疆生产建设兵团的石河子大学,中国(RCZK2018C13)。我们要感谢先生俾斯麦Kyei的英语编辑。

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