ECAM 循证补充和替代医学 1741 - 4288 1741 - 427 x 印地语 10.1155 / 2020/3573240 3573240 研究文章 乙酸乙酯馏分 Hedyotis diffusa+ 半枝莲通过OPN-FAK/ERK/NF-抑制骨转移乳腺癌细胞的迁移 κB轴 方 叮叮声 1 2 杨ydF4y2Ba Ying-Xuan 3. 杨 悦 1 Lv Ya-Xin 1 常 Qing-Qi 1 https://orcid.org/0000-0003-0591-2167 张 丹 1 Zarrelli 阿曼多 1 跨学科中西医结合研究所 上海中医药大学 上海201203 中国 shutcm.edu.cn 2 学院的药店 福建中医药大学 福建350122 中国 fjtcm.edu.cn 3. 学院的药店 上海中医药大学 上海201203 中国 shutcm.edu.cn 2020 10 4 2020 2020 03 11 2019 22 03 2020 23 03 2020 10 4 2020 2020 版权所有©2020方廷等。 这是一篇在知识共享署名许可下发布的开放存取的文章，它允许在任何媒体上无限制地使用、传播和复制，只要原始作品被适当地引用。

Hedyotis diffusa+ 半枝莲是一种常用的药物对联，用于治疗炎症相关疾病和各类肿瘤。然而，这种联用对肿瘤细胞迁移的影响尚未阐明。在ER +乳腺癌MCF-7骨转移亚系MCF-7 bom的帮助下，我们发现乙酸乙酯馏分以等重量比提取 Hedyotis diffusa+ 半枝莲(EA11)以浓度依赖性的方式抑制MCF-7-BOM的细胞迁移。为了明确其潜在的分子机制，我们发现EA11降低了骨桥蛋白(OPN)的表达，并干扰了FAK/ERK/NF- κB信号通路，两者都是乳腺癌骨转移的关键。本研究强烈提示EA11可能是一种潜在的治疗乳腺癌骨转移的药物。

 中国国家自然科学基金 81773946 81573673 81001666 上海中医药大学 201810268036 1.介绍

转移是全世界乳腺癌患者生存的严重威胁[ 1， 2，约65%的晚期乳腺癌患者发生骨转移。骨转移患者骨痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓受压，5年生存率约为20% [ 3.， 4］.传统的骨转移治疗方法包括放疗、化疗、靶向治疗、内分泌治疗和骨调节药物治疗。然而，目前可用的干预措施的有效性有限[ 5］.

骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)是由SPP1基因编码的一种分泌的乙醇-磷酸蛋白，参与骨重塑中的骨基质矿化和重吸收过程。OPN的异常表达可在多种肿瘤(乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤)中检测到，并与乳腺癌的发生、转移和预后密切相关[ 6， 7］.实验证据也支持OPN在乳腺癌骨转移中的作用。在最近的一项研究中，局灶粘附激酶(FAK)通路的激活被报道为opn诱导的细胞迁移的一个不可避免的事件[ 8］.研究还发现，OPN通过与ERK1/2的结合激活ERK1/2 αv β3整合素( 9]此外，OPN已被证明通过NF增强癌细胞的侵袭性- κb介导的信号传导机制[ 10］.这些发现表明，靶向opn相关信号通路可能是一种潜在的治疗乳腺癌骨转移的策略[ 11， 12］.

中医药在我国已被广泛应用于恶性肿瘤的辅助治疗。 Hedyotis diffusa，茜草科植物，含有黄酮类、多糖、三萜类、甾醇和萜类。许多成分 Hedyotis diffusa具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性。 Hedyotis diffusa通常用于治疗乳腺癌、结肠癌、肝癌和肺癌[ 13- - - - - - 15］. 半枝莲属于唇形科，也具有抗肿瘤活性， 半枝莲也常用于治疗各种肿瘤[ 16， 17］.特别是, Hedyotis diffusa+ 半枝莲常作为对联药用于治疗各种炎症相关疾病和癌症[ 18， 19］.

我们之前报道过EA11具有强大的抗炎活性[ 20.］.由于慢性炎症是癌症的标志之一，我们研究了EA11对MCF-7-BOM细胞迁移的影响，并进一步探讨了相关的分子机制。

 2.材料和方法 ２.１.试剂和化学物质

Hedyotis diffusa和 半枝莲购自上海洋河塘药业有限公司(中国上海张江高科技园区)，并经上海食品药品监督管理局(SIFDC)确认。MCF-7-BOM由美国密西西比大学Dr. Yu-dong Zhou提供。Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) medium dry powder、胎牛血清和0.25% trypsin从Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)中获得。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO, USA)。所用抗体的来源有Proteintech(芝加哥，IL，美国)的抗opn抗体(22952-1-AP)， Bioworld Technology (St. Paul, MN, USA)的anti-p-FAK (BS4718)，以及anti-FAK (#3285)， anti-NF- κB (# 3033), anti-p-NF - κB (#8242)， anti-ERK1/2(#9102)和anti-p- ERK1/2(#9101)来自Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA)。

 ２.２.EA11主要成分的制备与鉴定

EA11如前所述制备，并通过高效液相色谱进一步表征[ 20.］.

 2.3.细胞培养

MCF-7-BOM细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，在37℃，5% CO中培养2培养箱(Thermo, Waltham, MA, USA)。细胞每2-3天传代一次。

 ２.４.细胞生存能力分析

MCF-7-BOM细胞以2 × 10的密度接种于96孔板中3.然后用EA11（0,12.5,25,50,100和200）处理细胞  μg/ml)或0.25% DMSO(对照剂)处理72 h后，加入20 μ每孔加入1升5 mg/ml MTT溶液。孵育4 h后，取孔中培养上清液，100 μ加入l的DMSO溶液，使晶体完全溶解。490 nm处的光密度值由平板阅读器(Molecular Devices, CA, USA)测量。

 2．5．愈合试验

MCF-7-BOM细胞以6 × 10的密度接种于6孔板中5隔夜每孔细胞数。用无菌移液管尖端产生划痕，然后冲洗几次以去除脱落的细胞。然后在含有0、25和50的完整培养基中培养细胞  μg/ml的EA11，在100倍光学显微镜下(Olympus, Tokyo, Japan)于0,24和48 h拍照。通过监测间隙大小来确定细胞迁移。

 2.6。Transwell迁移分析

经或未经EA11处理24 h的MCF-7-BOM细胞被镀入上腔室(8 μ米孔隙大小;康宁公司，ME, USA)4每口井的电池数为600  μ下腔加入L无血清培养基。细胞迁移24 h后，用棉签去除上腔细胞，用0.5%结晶紫固定下腔表面细胞。在光学显微镜(200倍)下拍照，计数染色细胞，定量细胞迁移。

 2.7。入侵检测

为了评估MCF-7-BOM细胞的侵袭性，首先用或不用EA11处理细胞24小时，然后将细胞加入基质涂层Transwell板的上腔(8 μm孔径；康宁公司，美国ME），密度为2 × 105每口井的电池数为600  μ加入含5%胎牛血清的l培养基至下腔室。侵入22 h后，用棉签拭除上室残留的细胞，用0.5%结晶紫染色上室下表面的细胞。在光学显微镜(200倍)下计数染色细胞，测量体外浸润。

 2.8.蛋白质印迹分析

使用含蛋白酶的细胞裂解液(Beyotime Technology, Jiangsu, China)将细胞清洗并在冰上裂解。每个样品的蛋白浓度由BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)测定。蛋白质样品(30 μg/lane）在10%SDS-PAGE上分离并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭后，用相应的抗体对膜进行印迹，并使用ECL Western印迹检测试剂（美国马萨诸塞州贝德福德Millipore）在泰农成像系统（中国上海泰农）上对膜进行可视化。

 2.9。统计分析

使用SPSS版本20.0通过方差分析进行统计分析，所有实验重复至少三个独立实验。结果以平均值表示 ± SD.的价值 P < 0．05 被认为是重要的。

 3.结果 ３．１．EA11对MCF-7-BOM细胞生长的影响

为了确定EA11对MCF-7-BOM细胞生长的影响，用不同浓度的EA11处理细胞72小时 用MTT法检测细胞生长情况，并与未经处理的细胞进行比较，发现EA11在100  μg/ml显著抑制MCF-7-BOM细胞的生长( P < 0．05 )(图 1)，表示EA11浓度<100 µG /ml的细胞毒性很小。

EA11对MCF-7-BOM增殖的影响。MCF-7-BOM细胞在96孔培养皿中培养过夜。用EA11(0, 12.5, 25, 50, 100和200)处理这些细胞 μg/ml)或对照72 h，采用MTT法检测。 ∗ ∗ P < ０．０１ 与车辆。

 ３.２．EA11抑制MCF-7-BOM细胞的体外迁移和侵袭

如EA11浓度<100 µg/ml的细胞毒性很小，我们研究了浓度为25和50时EA11对细胞迁移的影响  μ克/毫升。创伤愈合和Transwell试验均表明，EA11以剂量和时间依赖性的方式阻止MCF-7-BOM细胞的迁移( P < 0．05 )(图 2）.在一个平行实验中，我们使用基质侵入室检测了EA11对MCF-7-BOM细胞侵袭的影响。当MCF-7-BOM细胞容易侵入Matrigel时，EA11以浓度依赖的方式阻断体外对这些细胞的侵袭( P < 0．05 )(图 3.）.

EA11对MCF-7-BOM细胞创面愈合的影响。(a)用移液管尖端产生划痕，在浓度为vehicle、25和50的条件下，用或不用EA11处理细胞 μg/ml。分别在0,24,24小时拍摄图像 h、 和48 h在相差显微镜下。（b）在载体浓度、25和50浓度下处理EA11，培养细胞  μ克/毫升。以车辆、25、50处理车辆、24、48 H三个随机场的机动性 μ克/毫升EA11。数据为平均值±SD。 n= 3。 ∗ P < 0．05 ， ∗ ∗ P < ０．０１ 与车辆。

EA11对MCF-7-BOM细胞迁移和侵袭能力的影响。(a)用载体、25和50处理细胞 μ24克/毫升 h，然后在200倍光学显微镜下使用Transwell分析细胞迁移。（b）对各组的迁移细胞进行计数。（c）用载体、25和50处理细胞  μg/ml处理22 h后，在200倍光镜下使用基质涂覆Transwell分析细胞侵袭。(d)计数各组受侵细胞数。 ∗ ∗ P < ０．０１ 与车辆。

 ３．３．EA11下调MCF-7-BOM细胞中OPN的表达

据报道，OPN参与乳腺肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并与骨肿瘤微环境相关[ 21］.为了确定EA11诱导的细胞迁移和侵袭抑制是否与OPN功能相关，我们分析了EA11对MCF-7-BOM细胞中OPN表达的影响。同样，我们在细胞迁移/侵袭中观察到，western blot显示EA11剂量依赖性地降低了MCF-7-BOM中OPN的丰度( P < 0．05 )(图 4）.

EA11对OPN蛋白表达的影响。用车辆、25和50处理mcf -7 bom电池后 μwesternblot检测EA11、OPN蛋白g/ml。 ∗ ∗ P < ０．０１ 与车辆。

 3．4．EA11干扰MCF-7-BOM细胞中FAK/ERK/NF-<italic>κ</italic>B信号通路

OPN与整合素的结合可调节乳腺癌细胞的迁移和侵袭，而黏着斑激酶（FAK）信号通路的激活对OPN调节细胞迁移/侵袭至关重要[ 8］.ERK/MAPK信号通路在FAK下游发挥作用，促进细胞迁移，而OPN水平升高与NF-升高相关 κB在乳腺和肝脏肿瘤中的活性[ 10］.为了研究ea诱导的OPN表达减少和这些信号通路之间的潜在联系，我们用浓度为0、25和50的EA11处理MCF-7-BOM细胞 μg/ml, western blotting检测磷酸化- fak、磷酸化- erk、磷酸化- nf - κB. FAK, ERK和NF-的磷酸化 κB在MCF-7-BOM细胞中可见。相反，EA11降低了FAK、ERK和NF-的磷酸化水平 κB ( P < 0．05 )(图 5)，提示FAK/ERK/NF-的干扰 κEA11发出的B信号很可能是EA11抑制OPN表达和细胞迁移/侵袭的原因。

EA11对FAK/ERK/NF-磷酸化的影响 κB信号通路。p-ERK, ERK, p-FAK, FAK, p-NF κB、 和NF- κ用western blot检测载体、25和50处理后的B蛋白表达 μEA11 g / ml。 ∗ P < 0．05 ， ∗ ∗ P < ０．０１ 与车辆。

 4.讨论

晚期乳腺癌常伴有肺、肝、脑和骨的临床转移[ 22］.在骨转移过程中，乳腺癌细胞必须经历一个侵袭转移级联过程，才能将自身转化为转移细胞[ 23， 24］.癌细胞到达骨位后往往集中在骨内膜，破坏骨微环境中成骨细胞和破骨细胞之间的微妙平衡。这种平衡的扭曲破坏了正常的骨重建和完整性，最终导致骨破坏[ 25， 26]在分子水平上，异常的骨保护素（OPG）-RANKL比率触发溶骨性转移的恶性循环[ 27， 28］.

乳腺癌和前列腺癌患者中OPN表达水平升高，预后差，生存期缩短。下调OPN表达已被证明可以阻止乳腺癌的进展和转移，表明OPN是肿瘤进展和转移的重要中介。OPN对骨显示出一种特殊的亲和力，这一事实进一步强调了它在骨转移中的重要性[ 7， 29， 30.］.在本研究中，我们发现EA11显著降低了MCF-7-BOM细胞中OPN的表达，并极大地抑制了细胞迁移和体外侵袭。

NF - κB激活对各种整合素信号传导和肿瘤转移至关重要[ 10］.NF - κB抑制剂已被证明能抑制opn诱导的细胞迁移[ 9]其中一个例子是用NF处理A549细胞- κB抑制剂(PDTC)或IkappaB蛋白酶抑制剂(TPCK)阻断opn诱导的肺癌细胞迁移[ 31］.最近的研究也表明，OPN可增加A549细胞中磷酸化- fak、AKT和ERK的水平，提示它们可能是OPN引导的细胞迁移的中介因子。由于opn刺激的ERK磷酸化被FAK突变体抑制，而FAK和ERK2突变体可以减少opn诱导的NF- κ这些研究结果表明，一个信号轴由FAK、ERK和NF-组成 κB调节OPN对细胞迁移和侵袭的调节[ 9]我们观察到EA11抑制乳腺癌细胞的迁移/侵袭，并干扰FAK/ERK/NF的激活- κB信号通路提示EA11可能是一种抗乳腺癌骨转移的活性药物。

 5.结论

我们的结果表明，EA11抑制MCF-7-BOM细胞的迁移。EA11导致的细胞迁移抑制很可能与OPN表达的抑制和FAK/ERK/NF的失活有关- κB信号通路。本研究提示EA11可能是一种治疗乳腺癌骨转移的潜在药物。

 数据可用性

用于支持本研究结果的原始数据可根据要求从相应作者处获得。

 的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

 作者的贡献

方廷、晏颖萱、杨乐乐对这部作品的贡献是相同的。

 致谢

国家自然科学基金项目(no . 81773946, no . 81573673, no . 81001666);上海中医药大学本科生创新项目(no . 201810268036)。关键词:边坡，边坡稳定性，边坡稳定性

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