JNA 杂志的核酸 2090 - 021 x 2090 - 0201 Hindawi 10.1155 / 2019/9170341 9170341 研究文章 DNA连接酶IV防止复制叉停滞,促进三阴性乳腺癌细胞扩散 Joshi Rashmi R。 1 阿里 Sk伊姆兰 1 http://orcid.org/0000 - 0001 - 6369 - 0094 阿什利 阿曼达·K。 1 Eritja 拉蒙 部门的化学和生物化学 新墨西哥州立大学 拉斯克鲁塞斯 88003纳米 美国 nmsu.edu 2019年 31日 1 2019年 2019年 07年 09年 2018年 27 11 2018年 05年 01 2019年 31日 1 2019年 2019年 版权©2019 Rashmi r . Joshi et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

DNA损伤是癌症的一个特点,保持基因组的突变和misregulation蛋白质忠诚与多种癌症的发展。DNA双链断裂是被认为是最有害的一种DNA损伤。的nonhomologous end-joining (NHEJ)途径是一种机制,修复DNA双链断裂和蛋白质参与NHEJ也可以调节DNA复制。我们先前建立DNA-PKcs NHEJ蛋白质,促进基因组稳定性和细胞生存能力细胞接触后复制压力;我们想要辨别是否另一个NHEJ蛋白质、DNA连接酶IV (Lig4),股票这种表型。我们的调查集中在三阴性乳腺癌细胞,,nonbasal乳腺癌相比, LIG4经常被放大,增加基因剂量与高Lig4表达式。我们耗尽Lig4使用核和证实击倒qPCR和免疫印迹。细胞生存与Lig4损耗减少,这是与复制叉拖延增加有关。检查点蛋白质Chk1 Lig4-depleted细胞激活和去磷酸化持平。Lig4损耗导致持续DNA-PKcs磷酸化后羟基脲曝光。理解的影响Lig4基因组复制和复制应激反应会澄清的生物抑制Lig4活动的影响。此外,Lig4是一个有吸引力的临床目标指导CRISPR / Cas9-mediated修复对homology-directed修复和远离NHEJ,从而减少Lig4如何影响细胞生物学的理解是至关重要的。

 美国国立卫生研究院的 P20GM103451 国家癌症研究所 U54CA132383 U54CA132381 牛仔癌症研究飞行员格兰特 1。介绍

了DNA损伤是癌症的标志和DNA损伤反应的异常功能蛋白是与许多癌症亚型( 1]。许多化疗药物诱导复制压力和合成DNA损伤;因此,DNA修复途径调节细胞对化疗耐药性干预和影响发展。最有害的病变,DNA双链断裂(双边带),可能出现损伤诱导内生和外生的来源,包括但不限于电离辐射,基因毒性化学物质、复制错误,和一代的活性氧和氮物种。在哺乳动物中,双边带主要是修复的两个主要途径:同源重组(人力资源)和nonhomologous end-joining (NHEJ,审查,请参阅[ 2, 3])。NHEJ是哺乳动物细胞的主要双边带修复途径 4),并在人力资源相比,并不依赖于同源DNA模板的可用性修复。人力资源被认为是“无错误”相比NHEJ由于模板的使用,是主要的修复通路细胞分裂期间负责DNA复制叉重启。

在NHEJ-mediated修复,双边带被Ku70 / Ku80二聚体,新兵DNA-PKcs,阿尔忒弥斯,DNA连接酶IV (Lig4) XRCC4 [ 2]。Lig4催化磷酸二酯键形成期间的最后一步NHEJ [ 2]。c端Lig4域包含两个衔接着排列BRCT域侧翼XRCC4-interacting领域,促进其相互作用与其绑定伙伴XRCC4 [ 5, 6]。结束处理会导致小插入或删除网站,所以NHEJ被认为是更多的“出错”修复通路与人力资源相比,尽管它修理的大多数细胞双边带( 4]。而DNA连接我和III参与其他形式的DNA代谢,Lig4的活动是完全与NHEJ [ 2]。而“古典”NHEJ,主要的双边带修复细胞内途径,与Lig4有关,通过替代修复end-joining通路可能是由DNA连接酶我或第三 7- - - - - - 9),尽管这些都不是经常使用。

除了双边带修复,人力资源在DNA复制减轻压力的作用是众所周知的( 11];然而,NHEJ蛋白是否也可以调节细胞复苏还不清楚。我们展示了细胞缺乏早期表演NHEJ蛋白质,DNA-PKcs,重启DNA复制比野生型由于无法充分激活/使磷酸化细胞蛋白参与DNA损伤反应,包括RPA32 Chk1和 γH2AX [ 10, 12, 13]。辨别是否异常复制重启NHEJ功能障碍,是由于我们撞倒Lig4决定它是否也有类似的作用在调节轻和/或损害DNA复制。我们调查了Lig4是否可能是一个公认的治疗目标在人力资源的一种疾病通常是妥协,即三阴乳腺癌(TNBC)。

TNBC的临床亚型乳腺癌缺乏核雌激素受体和孕激素受体,不生长因子受体HER2过表达。虽然不是所有基底癌症TNBC反之亦然,官腔TNBC是降低生存 14),是最常见的分类TNBC的约占70 - 80%的患者( 15]。TNBC患者遭受不良预后[ 16),较短的复发存活率,复发性疾病的风险更高( 17),因此死亡的风险增加肿瘤复发乳腺癌相对于其他类型的 18]。虽然TNBC患者面临着整体预后不良,五年后,复发和肿瘤死亡的风险降低到大约相同的水平non-TNBC [ 19]。这表明TNBC患者生存是高度依赖于防止复发和化疗抵抗。大约有80%的患者遗传变异与TNBC HR蛋白BRCA1礼物,和一个额外的61 - 69%的特点是“ BRCA洛克“相比其他39%的乳腺癌亚型( 20.]。因此,TNBC患者经常有妥协的人力资源,这可能会导致TNBC患者特别依赖NHEJ-mediated DNA修复。因此,我们试图理解的潜在治疗价值目标Lig4 TNBC和减少Lig4的细胞的影响。增加NHEJ有助于发展中抵抗化疗TNBC [ 21),所以针对这个途径通过干扰Lig4 TNBC可能提供一种新颖的治疗选项。

 2。材料和方法 2.1。TCGA分析

,TCGA数据库使用cBioPortal[审问 22, 23]。Lig4评估在所有乳腺癌异形METABRIC数据集,基本只有子集,所有乳腺癌类型不包括基底亚型( 24]。OncoPrint,表明观察基因改变,。cBioPortal被用来获得 LIG4mRNA表达z得分生成人类v3微阵列允许使用一个Illumina公司比较基因组的改变(深删除,浅删除,二倍体,增益,或放大)mRNA表达水平。这些术语的定义可用cBioPortal网站: http://www.cbioportal.org/faq。访问数据库的数据用于这个项目最后的2018年8月。

 2.2。细胞培养

除非另有说明,所有实验室化学物质都是购买的西格玛奥德里奇(圣路易斯,密苏里州)。人类乳腺癌细胞系BT549或MDA-MB231写明ATCC(马纳萨斯,弗吉尼亚州)和获得增长低于5%股份有限公司2在37°C在100%湿度。基本培养基(生命技术;卡尔斯巴德,CA)如下:BT549: DMEM / F12, MDA-MB231: DMEM,每个100单位/毫升补充10%的边后卫和青霉素和链霉素(技术)。细胞转染与核针对Lig4(试剂盒;希尔登,德国,猫# SI00036022)或不属预定目标的控制(NT);试剂盒负控制)10 nM使用时候RNAiMax(技术)表示。击倒的Lig4确认使用西方墨点法和/或qPCR为每个实验。

 2.3。qPCR

RNA被隔离和对列基因组DNA消化使用RNeasy迷你包(试剂盒)从细胞按照制造商的指示。RNA是量化使用NanoDrop 2000分光光度计(费舍尔科学、汉普顿,NH)。RNA样本存储在−80°C,直到进一步的分析。互补脱氧核糖核酸合成了1 μ 使用iScript cDNA g RNA合成工具包(BioRad大力神,CA)根据制造商的指示,然后用核酸酶稀释自由水的最终浓度10 ng / μl . qPCR执行与它连接的实时PCR检测系统(BioRad)使用iTaq普遍SYBR绿色Supermix (BioRad)。引物序列如下:使用Lig4: 5′TGC TGC TGA GTT GCA TAA TGT 3′, 5′AGC AGC标签猫TGG TTT TGA 3′(针对X83441.1设计);GTC GAPDH: 5′ACA AGC公司治理文化ATC TTC TT 3′, 5′ACG ACC AAA太极拳GTT广汽TC 3′(针对NM_002046.7设计)。在qPCR使用之前,我们保证引物组没有产生引物二聚体和底漆效率进行评估以确保在不同水平的开始等于放大模板。正向和反向引物用于最终浓度为0.5 μM 50 ng的互补。qPCR条件是3 95°C 40分钟,周期95°C(30岁),60°C (30 s), 72°C (15 其次是融化曲线。Cq的价值目标是标准化的Cq GAPDH通过的价值观 2 - - - - - - Δ Δ C 问 方法( 25]。的扩增子测序证实特异性(数据未显示)。

 2.4。DNA纤维测定

BT549细胞转染siRNA针对Lig4或NT描述。与胸苷细胞脉冲模拟5-iodo-2′脱氧尿苷(IdU;20. μ米)在完成生长介质和孵化15分钟37°C。媒体被和细胞与PBS洗3次短暂用胸苷(100紧随其后 μ米)。细胞暴露于新媒体包含第二胸苷模拟5-chloro-2′脱氧尿苷(CldU;20. μM)为20分钟37°C。另外,原始IdU脉冲后,细胞治疗与羟基脲(HU 10毫米)或车辆(PBS)一个小时完全生长介质在37°C。中被删除和细胞用PBS洗净,然后用CldU脉冲(20 μM)为30分钟37°C。在暴露于两个胸苷类似物,细胞受到DNA纤维测定( 10]。细胞被胰蛋白酶化然后洗PBS和收获resuspended PBS。二千个细胞被转移到一个带正电的显微镜幻灯片(Superfrost +国家,弗农山,IL),细胞溶解与裂解缓冲(0.5% SDS, 200毫米三pH值7.4,50 mM EDTA),在室温下和孵化3分钟。幻灯片在一个角被取消允许DNA纤维分布在幻灯片的长度,为8分钟脱水,并固定在刚做好的3:1甲醇:乙酸为5分钟。幻灯片又风干8分钟并存储在一夜之间70%的乙醇在4°C。第二天,幻灯片孵化在100%甲醇与PBS 5分钟,洗。除蛋白是由孵化在2.5 N HCl 37°C 1小时后通过阻断5%牛血清白蛋白在37°C,持续15分钟。IdU和CldU检测顺序使用荧光标记的第二抗体,抗体孵化项目都进行45分钟在37°C。简要IdU检测使用鼠标anti-BrdU抗体(费舍尔科学)其次是次要的山羊anti-mouse Alexa 568(生命技术)。CldU检测使用老鼠anti-CldU(准确的化学物质,坦佩AZ)和二级驴anti-rat Alexa 488(生命技术)。也准备了所有抗体稀释0.5%牛血清白蛋白和洗用PBS进行。幻灯片是安装使用延长™黄金不变色Mountant(费舍尔科学)。DNA纤维可视化和捕获使用蔡司Axioimager Z1机动显微镜配有XCite LED光源,数字化Apotome 506结构化照明模块和Axiocam CCD相机。 Replication forks labelled only red (IdU positive only) were defined as stalled forks, those labelled only green (CldU positive only) were defined as new forks and those labelled both red and green (IdU+CldU) were defined as restarted forks. Images were scored by the person who was blinded to the sample identity. Data was analyzed as stalled or restarted or new forks and determined as a percent of the total number of forks scored per image. Mean, standard deviation was calculated for each treatment condition from all the scored images per condition.

 2.5。西方墨点法

BT549细胞生长在60毫米文化板块每盘500000个细胞的浓度。在转染后24小时,细胞治疗从力学上看有四个不同的复制毒素(阿霉素、强力霉素、1 μM;依托泊苷ETOP修建10 μM;胡,2毫米;喜树碱,CPT, 0.2 μ米)或车辆(DMSO)和蛋白质提取后24小时的治疗。pChk1和pChk2实验BT549细胞治疗10毫米胡锦涛或车辆(PBS) 1小时或24小时和蛋白质是收获后立即治疗。Chk1和相关的实验中,脱磷酸化BT549细胞治疗10毫米胡锦涛或PBS 1小时,发布表示次蛋白质收获紧随其后。为pDNA-PKcs S2056实验,BT549细胞治疗10毫米胡锦涛PBS为1小时或24小时,2小时的完整细胞生长媒体发布蛋白质收获紧随其后。得到了完整的细胞溶解产物使用缓冲区里帕[50 7.4毫米三(pH), 2 mM EDTA, 150 mM氯化钠,0.1% SDS, 1.0% Triton x - 100)补充停止磷酸酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(费舍尔科学)]。蛋白质是使用皮尔斯BCA量化分析(费舍尔科学)制造商的指示。蛋白质(15或30 μg)受到了sds - page和转移到PVDF膜。膜被封锁与牛奶5%或5% BSA 1 x tris-buffered盐水Tween-20 0.1% (TBS-T)在室温下一个小时。主要的抗体稀释在屏蔽解决方案和孵化一夜之间在4°C。膜清洗在1 x TBS-T和适当HRP-conjugated二级抗体阻断缓冲区中申请一个小时在室温下。墨迹洗TBS-T,清晰西方ECL衬底(BioRad猫# 1705061)应用之后,检测使用ChemiDoc议员的化学发光成像系统(BioRad)。以下主要抗体被用于:Lig4 DNA-PKcs和pDNA-PKcs S2056 (Abcam,剑桥,英国), β肌动蛋白和Vinculin(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)和GAPDH裂解半胱天冬酶3,半胱天冬酶9日 β微管蛋白、pChk1-S317 pChk1-S345,总Chk1, pChk2-T68或总相关(细胞信号技术,丹弗斯,MA)。二次抗体使用:HRP-conjugated山羊anti-rabbit和山羊anti-mouse(杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)。

 2.6。细胞生存能力

细胞生长在一夜之间在96 -白盘子(合演,康宁,纽约)和随后转染siRNA Lig4或NT 72人力资源。CellTiter如果发光细胞生存能力分析(Promega,麦迪逊,WI)是按照制造商的说明用来量化可行的细胞转染后72小时。评估单独生存,BT549细胞转染24小时然后转染细胞被播种到60毫米菜肴的播种密度500细胞/板。细胞被允许附加4人力资源和孵化37°C为7 - 10天新鲜媒体补充每三天。孵化后,细胞与1 x PBS洗一次,其次是在4%多聚甲醛固定细胞,持续15分钟。然后沾0.5%结晶紫在20%甲醇为2小时。细胞是用水洗,脱水,殖民地≥50个细胞数。电镀效率计算PE =(#殖民地形成/ #细胞添加) ∗ 100年和幸存的分数(SF)被计算为:科幻小说= (PE Lig4耗尽细胞/聚乙烯NT) ∗ One hundred.对于所有化验,实验至少重复三次三个复制在每个实验。

 2.7。免疫荧光

一夜之间细胞种植在四级室幻灯片和转染核针对Lig4或炒控制(NT) 24小时。细胞治疗与PBS为24小时,4%多聚甲醛固定10分钟,permeabilized 0.1% Triton x - 100 1分钟,洗,然后封锁在1%的牛血清白蛋白在室温下30分钟。主要的抗体识别p-S139-H2AX ( γH2AX;Abcam)应用于阻塞1小时在室温下的解决方案。细胞用PBS和一个Alexa萤石488 -共轭二次抗体(英杰公司)是应用于阻塞1小时在室温下的解决方案。细胞被清洗和安装在延长™黄金不变色Mountant包含DAPI(费舍尔)。图像捕捉数字用蔡司Axio成像仪显微镜使用绿色和蓝色的渠道 γ分别H2AX和DAPI。每个条件10图片被抓获。 γH2AX疫源地量化使用ImageJ软件与DAPI染色区域定义为感兴趣的区域(ROI)。Non-DAPI染色区域用于占背景荧光和从每个减去 γH2AX平均信号强度值。平均信号强度 γH2AX是规范化DAPI染色面积/形象。

 2.8。统计分析

所有统计分析使用GraphPad棱镜(拉霍亚,CA)。耶茨的校正卡方分析被用来评估 LIG4基因改变的肿瘤分子分类;p值决定使用一个双边确切概率法。的影响 LIG4基因剂量mRNA表达水平是评估通过单向方差分析和线性趋势从左到右是评估 事后。细胞生长的统计分析评估线性回归加上一个额外的平方和F检验。除非另有指示,细胞暴露于NT或Lig4 siRNA比较使用双尾内治疗 t测试。

 3所示。结果 3.1。Lig4损耗降低细胞生存能力

评估的患病率 LIG4在基底与non-basal乳腺癌基因改变,我们审问METABRIC群乳腺癌患者在癌症基因组图谱特征使用cBioPortal TCGA ()。放大的 LIG4是观察到1.8%的乳腺癌代表METABRIC的2509个样本数据集(2018年8月访问)。209例患者分为基底的显著比例更高,8.1%, LIG4放大1.3%相比其他分子亚型(图中观察到 1(一),p < 0.0001)。确定这些基因改变引起的表达水平增加,我们评估mRNA表达z得分生成使用Illumina公司TCGA人类v3微阵列(图 1 (b))。对于每个数据集,一个普通的单向方差分析完成询问是否mRNA的平均值不同个体间的基因差异,即通过一个线性趋势的评估从最严重的负面基因改变(深删除non-basal和浅删除基底乳腺癌患者,分别)对那些窝藏基因剂量的积极的变化:放大。这些结果的总结提出了补充表 1。显著增加 LIG4表达基底中可观察到患者(斜率= 0.1735,p < 0.0001),但不是non-basal队列(斜率= 0.02979,p = 0.8348),表明基底患者增加的mRNA水平增加 LIG4基因剂量(图 1 (b))。调查Lig4在乳腺癌的作用,特别是TNBC,我们耗尽Lig4在基底乳腺癌细胞系和证实了使用qPCR击倒(数字 1 (c)和 1 (d))和免疫印迹(数字 1 (e)和 1 (f))。我们评估Lig4损耗的影响细胞生存能力击倒后72小时后,观察到朴素显著减少细胞生存能力(数据 2(一个)和 2 (b))由于减少细胞Lig4水平。我们使用单独分析调查Lig4耗尽细胞的生殖细胞死亡( 26]。TNBC细胞的生存与贫化Lig4水平来控制细胞(图相比下降约50% 2 (c))。Lig4损耗并没有显著增加细胞对复制毒素(补充图 1和数据未显示)。

LIG4在不同的乳腺癌亚型放大。(a)结果产生cBioPortal METABRIC乳腺癌(BRCA)数据集的分析(2018年4月访问)。 LIG4放大观察到8.1%的乳腺癌患者基底(n = 209),更频繁的改变相比,包括放大和深删除,观察到1.3%的病例在乳腺癌亚型的数据不包括基底(n = 2300例;p < 0.0001)。(b)在所有nonbasal BRCA基因改变的患者 LIG4没有改变mRNA表达相关的(n = 2300, p = 0.8348)而积极的协会中检测出患者基底BRCA (n = 209, p < 0.0001)。细胞转染与单个构造核针对Lig4或炒控制(NT) 24小时和48小时。使用qPCR Lig4损耗确认(c, d;* p < 0.05;数据绘制意味着+ SEM)和免疫印迹(e: BT549 f: MDA-MB231)。

Lig4损耗减少细胞生存能力和集落形成能力。(a, b)细胞生存能力评估使用CellTiter如果试验72小时与核转染后针对Lig4或炒控制(NT; ∗ p < 0.05)。(c) BT549细胞耗尽Lig4或炒控制和接受单独试验( ∗ ∗ n = 3, p < 0.01)。

 3.2。Lig4击倒减少细胞生存能力没有提高细胞凋亡

确定增强生存能力的下降是由于细胞凋亡我们评估凋亡指标。Lig4耗尽细胞的复制水平处理已知毒素诱导的细胞死亡(数据未显示):CPT (0.2 μ米),胡锦涛(2毫米),ETOP修建(10 μ米)、阿霉素(1 μ米)或车辆(DMSO) 24 h。蛋白质收获是凋亡指标的评估使用免疫印迹表达裂解半胱天冬酶3和半胱天冬酶9。凋亡指标的水平被观察到类似Lig4枯竭和控制(NT)细胞(图 3 (c)和补充数据 2和 2 b)建议没有健壮的增强与Lig4消耗相关的细胞凋亡后单独或有毒的侮辱。我们采用细胞计数分析评估改变细胞增殖。细胞计数每24小时Lig4击倒后长达120小时。抑郁的细胞积累在Lig4-depleted细胞相比NT(数字 3(一个)和 3 (b)),表明可能抑制细胞分裂。

Lig4击倒没有增强细胞凋亡细胞数量下降的原因。(a, b) Lig4耗尽或控制(NT)细胞数每24小时120小时。线是线性回归( ∗ p < 0.05; ∗ ∗ ∗ n = 3, p < 0.001)。(c)水平的凋亡标记裂解caspase-3和9是评估使用免疫印迹Lig4枯竭和控制细胞治疗与复制毒素(1 μ阿霉素,2毫米羟基脲,10 μ依托泊苷,或0.2 μ喜树碱)或DMSO溶液。

 3.3。Lig4防止复制叉停滞

辨别是否减少细胞数量在复制叉Lig4损耗是由于改变后动态,我们采用DNA纤维测定。在Lig4耗尽细胞中,我们观察到的百分比的增加停滞复制叉相比,控制细胞(图 4和补充表 2)。细胞暴露在PBS一小时前收到第二个胸苷模拟演示类似的结果(补充图 3和补充表 3)在细胞暴露于复制压力,正如所料,数量显著增加的停滞叉观察与相应减少重启叉Lig4耗尽细胞的数量与NT细胞(补充图 3 b和补充表 3)。观察到的差异可能是由于Lig4损耗而不是添加复制毒素明显增强。我们的研究结果表明,Lig4损耗影响基底TNBC的复制水平细胞。

Lig4损耗改变基底的复制水平。(a, b) BT549细胞治疗可以阻止针对Lig4或炒控制(NT)和DNA复制使用DNA纤维分析评估。短暂,细胞顺序脉冲和胸苷类似物诱导器CldU和DNA纤维进行了分析 10]。对于每一个治疗,停滞不前,新的和重新启动复制叉在炫目的治疗后得分。百分比的停滞,新的和重新启动复制叉在Lig4耗尽细胞与各自的NT控制细胞( ∗ p < 0.05)。

 3.4。Lig4减少不改变检查点激活

增加一个解释复制叉拖延可能是DNA损伤检查点信号的增强。Chk1和相关的检查点通过磷酸化蛋白质激活响应DNA损伤和已知DNA损伤介质的信号。我们评估Chk1和压力相关的磷酸化和去磷酸化后复制。Chk1被磷酸化两个DNA损伤后残留物,S317并在T68 S345而相关的磷酸化。磷酸化和总Chk1评估使用一个免疫印迹(图 5(一个)NT和Lig4之间),类似的治疗方法。Lig4枯竭和NT细胞有类似水平的Chk1脱磷酸作用(图 5 (b))。相关的磷酸化和去磷酸化T68 Lig4损耗(数据也不变 5 (c)和 5 (d))。这些结果表明Lig4损耗原因没有障碍在激活或灭活检查点信号。

Lig4损耗不增加Chk1或者相关的磷酸化和去磷酸化。pChk1 (Ser317或Ser345), pChk2 (Thr68),总Chk1,通过免疫印迹或总相关的评估。实验重复三次。(a, c) Lig4耗尽或炒控制治疗(NT)细胞治疗10毫米羟基脲或PBS 1或24小时。(b, d) Lig4耗尽或NT细胞治疗与10毫米胡锦涛或PBS 1小时,表明次发布。

 3.5。Lig4损耗增加基底<斜体>γ< /斜体> H2AX水平

我们检查了没有解决造成持久的双边带的可能性减少Lig4含量可能会损害细胞的复制。H2AX是磷酸化S139(称为组蛋白变体 γH2AX)为了应对双边带 27]。理解如果Lig4损耗引起的双边带的增加,我们评估的形成 γH2AX焦点在Lig4枯竭和控制细胞。TNBC细胞转染siRNA针对Lig4或炒PBS 24小时的处理和控制 γH2AX使用免疫荧光检测。我们观察的增加 γH2AX焦点在Lig4耗尽细胞(图 6和补充表 4)。增加 γH2AX Lig4耗尽细胞的焦点很可能表明持续自发地出现未解决双边带。

Lig4损耗仅增加了持久性的DNA双链断裂。BT549细胞转染siRNA针对Lig4或炒控制(NT)其次是疣状 γH2AX疫源地。 γH2AX疫源地量化使用ImageJ软件与DAPI染色区域定义为每个图像和得分的。平均信号强度 γH2AX是规范化DAPI染色面积每图像( ∗ ∗ ∗ p < 0.001)。

 3.6。Lig4损耗增加DNA-PKcs的磷酸化

除了作为一个关键的角色NHEJ蛋白质,Lig4可能促进DNA-PKcs自身磷酸化在S2056电离辐射( 28]。我们评估Lig4损耗的影响DNA-PKcs S2056自身磷酸化。TNBC细胞有或没有Lig4击倒服用10毫米胡锦涛或车辆1小时或24小时并发布2 h后完全生长介质显示治疗时间。pDNA-PKcs S2056和总DNA-PKcs通过免疫印迹(图水平进行评估 7(一))。我们发现Lig4耗尽细胞表现出增加水平的pDNA-PKcs S2056复制与长时间暴露于压力,这可能导致复制叉崩溃和双边带(图 7 (b))。水平的提高pDNA-PKcs S2056导致有限的终端处理( 29日),而现有的双边带不能修复由于Lig4的衰减,导致持续的双边带。

Lig4损耗导致的水平增加pDNA-PKcs S2056。(一)Lig4耗尽BT549或炒控制(NT)治疗细胞治疗与胡锦涛或PBS和分离蛋白中概述的方法部分。的磷酸化DNA-PKcs Ser 2056使用免疫印迹和总DNA-PKcs水平进行评估。(b)微密度分析的三个生物复制。加载控制(vinculin)归一化平均强度值pDNA-PKcs S2056每次治疗第一次归一化总DNA-PKcs其次是规范来控制细胞处理车辆(1 h)值( ∗ ∗ n = 3, p < 0.01)。Untransfected BT549细胞溶解产物作为消极的控制和溶菌产物从10 Gy辐照BT549细胞作为阳性对照。

 4所示。结论

Lig4经常被放大,导致高架mRNA表达在乳腺癌患者基底。虽然不是多余的条款,大多数TNBC乳腺癌被划分为基底,反之亦然。评估的效用目标Lig4 TNBC的子类型与预后不良和缺乏药物靶点,我们撞倒Lig4水平基底TNBC细胞系和观察温和但生存能力明显下降(数字 2(一个)和 2 (b))和减少单独生存(图 2 (c))。Lig4耗尽细胞数量相对缓慢(数字 3(一个)和 3 (b)细胞凋亡(图)没有相应增强 3 (c))。进一步,我们观察到停滞的百分比增加DNA复制叉有一个关联的下降百分比新复制叉Lig4击倒细胞(图 4和补充图 3(一个))。综上所述,这些数据表明Lig4损耗影响基底的水平的细胞复制。

我们评估了可能的解释为减少TNBC复制失败而导致Lig4减少包括hyperactivation或灭活复制检查站在未修理的双边带信号和/或海拔。Chk1和相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化其他下游DNA损伤反应效应蛋白,最终促进细胞周期阻滞和阻塞G2 / M过渡( 30., 31日]。Chk1和相关的激活后急性(1 h)或长时间(24小时)暴露在胡锦涛的击倒,这表明Lig4不控制自己激活(数字 5(一个)和 5 (c))。类似地,时间调查Chk1或相关的去磷酸化后复制应力表明,平息检查点激活不是依赖Lig4(数字 5 (b)和 5 (d))。我们评估的形成 γH2AX焦点在Lig4枯竭和控制细胞,这转译后的修改是指示性的双边带( 27]。我们观察的增加 γH2AX疫源地Lig4损耗(图 6)。添加一个复制毒素没有大幅提高 γH2AX疫源地形成Lig4击倒细胞(数据未显示)。总的来说,我们的数据表明,增加 γH2AX Lig4耗尽细胞的焦点很可能由于持续自发出现解决双边带,导致细胞增殖率下降。

在S2056 Lig4可能导致DNA-PKcs自身磷酸化后电离辐射( 28),这一修改结果增加DNA-PKcs协会与DNA在争端解决机构网站 29日]。DNA-PKcs是一个非常大的蛋白质(约469 kDa)及其存在的争端解决机构限制访问结束处理因素的DNA损伤网站( 32]。因为人力资源需要结束处理维修,这些双边带可能会优先通过NHEJ修复通路( 32]。我们评估Lig4损耗的影响DNA-PKcs S2056自身磷酸化。在我们的试验中,Lig4损耗水平的提高pDNA-PKcs S2056与长时间暴露于复制压力(数据 7(一)和 7 (b))似乎与以前公布的结果表明Lig4促进pDNA-PKcs S2056 [ 28]。然而,Cottarel等人证明虽然废止(淘汰赛)Lig4防止S2056磷酸化,引入最小数量的Lig4,出现在我们的化验,足以推动dna - pk磷酸化( 28]。我们相信这海拔DNA-PKcs磷酸化指示未修理的DNA的损伤,是由于Lig4击倒。在我们的结果中,持续暴露在胡锦涛结果复制叉崩溃导致双边带的积累,至今还未修理的由于Lig4损耗防止NHEJ-mediated修复加上断头的dna - pk无法分离,以便HR-mediated修复( 32]。我们先前描述的角色在细胞反应DNA-PKcs复制压力( 10, 12),它们不同于什么是观察与Lig4损耗。这表明DNA-PKcs行为超出了它的角色在复制叉NHEJ复苏,尽管Lig4的角色在细胞生存能力符合NHEJ的核心作用。我们的研究结果表明Lig4促进细胞生存通过决议的通过NHEJ自发的DNA损伤,会确保离解DNA-PKcs DNA允许结束处理和HR-mediated修复。

我们的研究的临床影响是多方面的。这些结果表明,复制压力的敏感性证明了我们的实验室和其他当DNA-PKcs删除或抑制冗余与地位NHEJ蛋白质并会显示其他的敏化机制。进一步,我们的结果表明适度减少细胞生存能力通过减少TNBC Lig4水平,然而衰减Lig4活动与深刻的增强对电离辐射的敏感性( 33]。因此,抑制Lig4可能有益的结合治疗应用fda breast-specific GammaPod立体定向放射治疗设备,它提供了一个高(8 Gy),但局部乳腺癌治疗的放射剂量( 34]。我们预计Lig4损耗将增强电离辐射出功效的乳腺癌治疗。Lig4抑制的临床影响是至关重要的考虑到导演双边带修复的上下文中对人力资源与NHEJ CRISPR / Cas9-mediated疗法。具体来说,homology-directed更换异常的基因,这是深刻的临床应用,取决于利用HR-mediated双边带修理而不是NHEJ和现代分子医学是一个主要的重点。与其他与NHEJ相关的蛋白质相比,Lig4活动主要是限于NHEJ-mediated修复,使这一目标高的临床价值。因此,理解Lig4减少活动的生物的影响是至关重要的通知未来疗法不仅在癌症生物学,但是跨多个疾病状态。

 数据可用性

TCGA资料来自METABRIC乳腺癌数据集如上所述。可以通过访问这些数据,TCGA数据门户虽然cBioPortal https://portal.gdc.cancer.gov或http://www.cbioportal.org。其余的数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

作者要感谢Drs。江淮Nickoloff、瑞安阿什利和克里斯·坎普有价值的输入在这个项目。我们还要感谢格蕾丝钩,梅丽莎·查韦斯,克丽丝汀Tso,约翰•Cavaretta Prisila拉米雷斯,富勒和麦迪逊的援助项目。研究报告在这份出版物是由一个机构开发奖(想法)医学科学研究所的美国国立卫生研究院(P20GM103451),癌症研究的促进伙伴关系:NMSU / FHCRC,支持部分由国家拨款(U54CA132383 NMSU U54CA132381 FHCRC),和牛仔癌症研究飞行员格兰特,所有授予阿曼达·k·阿什利。

 补充材料

年代 u p p l e 米 e n t 一个 l 图 1:阿霉素由于Lig4损耗没有增强细胞死亡。Lig4枯竭和控制细胞(NT)受到暴露后单独测定不同剂量的阿霉素(0.03,0.1,0.3,1.0,3.0,10日,30日或100海里)。实验重复三次。 补充图 2:Lig4击倒不提高半胱天冬酶的激活。(A, B)凋亡水平标记裂解caspase-3和caspase-9评估使用免疫印迹Lig4枯竭和控制细胞治疗与复制毒素(1 μ阿霉素,2毫米羟基脲,10 μ0.2 M依托泊苷, μ喜树碱)或DMSO溶液。意味着强度值的裂解caspase-3或caspase-9第一规范化加载控制, β微管蛋白之后,第二个正常化车辆控制细胞(NT)治疗。实验重复四次,提出了微代表标准偏差与误差。 补充图 3: Lig4损耗并不显著加剧hydroxyurea-induced复制叉停滞。(A, B) BT549细胞治疗可以阻止针对Lig4或炒控制(NT)和DNA复制使用DNA纤维分析评估。短暂,细胞脉冲和胸苷类似物诱导器CldU隔开治疗与PBS (A)或10毫米羟基脲(胡;B)。对于每一个治疗,停滞不前,新的和重新启动复制叉在炫目的治疗后得分。百分比的停滞,新的,并重新启动复制叉在Lig4耗尽细胞与各自的NT控制细胞( ∗ p < 0.05, ∗ ∗ p < 0.01, ∗ ∗ ∗ p < 0.001)。 补充表 1:拷贝数改变Lig4在基底与Lig4 mRNA表达增加有关但不是nonbasal乳腺癌患者。mRNA表达z分数使用人类v3 Illumina公司生成微阵列的癌症基因组图谱(TCGA)检索利用从患者cBioPortal基底(n = 209)或nonbasal (n = 2300)乳腺癌(BRCA)。TCGA mRNA水平分层的拷贝数报道使用单向方差分析和比较图基的多个对比测试(n .紧随其后。=不显著, ∗ p < 0.05, ∗ ∗ p < 0.01, ∗ ∗ ∗ p < 0.001)。深删除没有报道基底BRCA数据集。 补充表 2:统计图的详细信息4所示。每个幻灯片每治疗是可视化和图像捕获整个长度的幻灯片。图像数量得分每治疗表所示。纤维被得分为红叉(停止),绿色(新叉子),或红+绿(重启叉)。纤维的总数得分为每个治疗是上市。停滞不前、新和重启叉被指示为总数的百分比叉为每个治疗条件。 补充表 3:统计细节关于补充图 3。每个幻灯片每治疗是可视化和图像捕获整个长度的幻灯片。图像数量得分每治疗表所示。纤维被得分为红叉(停止),绿色(新叉子),或红+绿(重启叉)。纤维的总数得分为每个治疗是上市。停滞不前、新和重启叉被指示为总得分的比例叉为每个治疗条件。 补充表 4:统计图的详细信息6。细胞被可视化在63 x油浸10图片在每治疗被抓获。 γH2AX疫源地量化使用ImageJ软件与DAPI染色区域定义为感兴趣的地区。Non-DAPI染色区域用于占背景荧光和从每个减去 γH2AX平均信号强度值。平均信号强度 γH2AX是规范化DAPI染色面积/形象。

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