1。介绍
白细胞介素- 6 (il - 6)是一种多功能的细胞因子,具有重要的生理效应等多种功能促进b细胞分化、t细胞活化,诱导急性期蛋白(
1 - - - - - -
4 ]。人们普遍认识到,两个功能细胞,成骨细胞和破骨细胞,严格规范骨代谢,前者负责骨形成和骨吸收(后者
5 ]。骨结构的形成和骨重建的结果耦合过程;通过激活破骨细胞骨吸收与后续沉积新矩阵的成骨细胞。在骨代谢中,认识到,il - 6是最有效的osteoclastogenic因素之一(
3 ,
4 ]。骨吸收是由本地生产的增加炎症细胞因子,如肿瘤坏死因子-
α 和il - 1。在成骨细胞(
6 - - - - - -
8 ),据报道,骨吸收剂如肿瘤坏死因子-
α 和il - 1刺激il - 6的合成。至于骨代谢,il - 6已被证明刺激骨吸收和诱导破骨细胞的形成
3 ,
4 ,
7 ,
9 ]。因此,越来越多的证据表明,il - 6分泌的成骨细胞起着关键作用的下游效应骨吸收剂。它已经表明,血小板源生长factor-BB (PDGF-BB),一个著名的促有丝分裂的因素,增加扩散和抑制成骨细胞的分化
10 ]。PDGF-BB也增强了骨吸收增加破骨细胞的数量,影响可能继发于增加il - 6的表达(
10 ,
11 ]。因此,调制PDGF-BB效应将会是一个可能的治疗骨质疏松症的目标。在我们最近的研究(
12 ,
13 ),我们报道,PDGF-BB刺激il - 6合成激酶通过p44 /页地图,地图p38激酶,压力激发了蛋白激酶(SAPK) / c-Jun
N 终端(物)、MAP激酶家族成员(
14 ),在osteoblast-like MC3T3-E1细胞和一种蛋白激酶,p70 S6激酶限制了合成。然而,PDGF-BB底层的确切机制造骨细胞的il - 6合成尚未阐明。
化合物的食物,比如蔬菜和水果有人类有益的属性。其中,据报道,黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤的作用[
15 ,
16 ]。儿茶素是一种主要的类黄酮,它存在于各种植物的物种如绿茶(
16 ]。在骨代谢,它已被证明,儿茶素抑制骨吸收
17 ]。至于破骨细胞,有报道称(−)儿茶素没食子酸盐(EGCG)诱导破骨细胞凋亡(
18 ,
19 和抑制分化
20. ]。然而,EGCG的影响细胞因子的表达或从osteoclast-stimulated或对成骨细胞的细胞基质降解酶尚未报道据我们所知。至于成骨细胞,它已经表明,儿茶素刺激碱性磷酸酶活动,一个成熟的成骨细胞表型(
5 ),减少细胞凋亡在osteoblast-like MC3T3-E1细胞(
21 ]。然而,儿茶素在成骨细胞的确切机制尚不完全清楚。
在目前的研究中,我们调查是否(−)儿茶素酸酯(EGCG)的一个主要绿茶类黄酮,影响PDGF-BB-stimulated il - 6合成osteoblast-like MC3T3-E1细胞和其背后的机制。我们这里显示EGCG减少PDGF-BB-stimulated通过衰减SAPK / il - 6的合成物在这些细胞通路。
2。材料和方法
2.1。材料
重组PDGF-BB, il - 6 ELISA、骨钙蛋白ELISA和osteoprotegerin(功能)酶联免疫试剂盒购自研发系统,Inc .(美国明尼苏达州明尼阿波利斯)。EGCG是来自Calbiochem-Novabiochem集团(美国加州拉霍亚)。Phospho-specific PDGF受体
β 抗体,PDGF受体
β 抗体,phospho-specific p44 /页MAP激酶抗体,p44 /页MAP激酶抗体,phospho-specific p38 MAP激酶抗体,p38 MAP激酶抗体,phospho-specific SAPK /物激酶抗体,SAPK /物抗体,phospho-specific Akt抗体,Akt抗体,phospho-specific p70 S6激酶抗体,和p70 S6激酶抗体购买从细胞信号技术(美国贝弗利,质量)。发射极耦合逻辑免疫印迹检测系统从Amersham购买日本(日本东京)。其他材料和化学品从商业来源获得。
2.2。细胞培养
克隆的osteoblast-like MC3T3-E1细胞,来源于新生儿老鼠头顶(
22 ),是维护如前所述[
23 ]。简而言之,这些细胞被培养
α 最小基本介质(
α mem)含10%胎牛血清(FCS) 37° C在湿润的气氛中5%的有限公司2 空气/ 95%。细胞被播种到35毫米直径菜(
5
×
10
4
/盘)或90毫米直径的菜肴(
5
×
10
5
/盘)
α 包含10% FCS mem。5天之后,是交换媒介
α 包含0.3% FCS mem。48小时后细胞用于实验。
Primary-cultured成骨细胞得到头顶的新生儿(1或者为期两天的旧)balb / c小鼠如前所述[
24 ]。他们被播种到直径90毫米的菜(
25
×
10
4
细胞)
α 包含10% FCS mem。每3天中被改变,直到细胞达到融合在5天。然后,是交换媒介
α 包含0.3% FCS mem。48小时后细胞用于实验。
2.3。骨钙素的分析、功能和il - 6的分泌
培养细胞是用汽车或各种剂量的EGCG预处理(1到30
μ 米)24小时,骨钙素的水平和功能在中被各自的酶联免疫试剂盒测量。培养细胞被PDGF-BB 1毫升的刺激
α mem含有0.3% FCS,然后孵化的显示时间。条件培养基收集,在中就以il - 6和il - 6的酶联免疫试剂盒。表示时,细胞用不同剂量的EGCG预处理为60分钟。
2.4。实时rt - pcr
培养细胞使用30
μ M EGCG或车辆为60分钟,然后刺激50 ng / mL PDGF-BB 60分钟。总RNA是孤立和转录成互补DNA使用试剂盒试剂和Omniscript逆转录酶工具包。实时rt - pcr进行使用光周期计系统(瑞士巴塞尔罗氏诊断)毛细血管和DNA由于“快速上手”项目主SYBR绿色我提供的工具包。感觉和反义引物合成基于辛普森et al.for鼠标GAPDH mRNA的报告(
25 ]。意识和反义引物对小鼠il - 6 mRNA买来豆类生物有限公司(日本东京)(引物组ID: MA039013)。放大产品由融化曲线分析和琼脂糖电泳。il - 6 mRNA水平正常化与GAPDH mRNA。
2.5。免疫印迹分析
培养细胞被PDGF-BB刺激
α mem含有0.3% FCS的显示时间。这些细胞被洗两次磷酸盐和细胞溶解,均质,和用裂解缓冲包含62.5毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值6.8,2%十二烷基硫酸钠(SDS), 50毫米二硫苏糖醇,甘油10%。胞质分数收集离心后上清液
125年
,
000年
在4 g×10分钟° c . SDS-polyacrylamide凝胶电泳(页面)是由Laemmli [
26 在10%的聚丙烯酰胺凝胶。免疫印迹分析如前所述[
27 通过使用phospho-specific PDGF受体)
β 抗体,PDGF受体
β 抗体,phospho-specific p44 /页MAP激酶抗体,p44 /页MAP激酶抗体,phospho-specific p38 MAP激酶抗体,p38 MAP激酶抗体,phospho-specific SAPK /物激酶抗体,SAPK /物抗体,phospho-specific Akt抗体,Akt抗体,phospho-specific p70 S6激酶抗体,和p70 S6激酶抗体与peroxidase-labeled抗体在山羊长大对兔免疫球蛋白被用作第二抗体。过氧化物酶活动PVDG膜在x射线胶片通过可视化ECL免疫印迹检测系统。表示时,细胞用不同剂量的EGCG预处理为60分钟。
2.6。决定
酶免疫分析法测定样品的吸光度与厄尔340 450海里生物动力学读者(Bio-Tek仪器有限公司、Winooski Vt,美国)。使用分子的光密度分析分析师/ Macintosh(美国加州Bio-Rad实验室、大力神)。
2.7。统计分析
分析的数据方差分析其次是Bonferroni多重比较方法对,和一个
P
<
0。
被认为是显著的。所有数据给出的意思
±
扫描电镜一式三份的决定。每个实验重复三次类似的结果。
3所示。结果
3.1。EGCG对PDGF-BB-Stimulated MC3T3-Cells和Primary-Cultured老鼠成骨细胞il - 6的合成
据报道,PDGF-BB诱发转录鼠成骨细胞的il - 6 (
11 ]。我们曾发现PDGF-BB刺激il - 6的合成在鼠标osteoblast-like MC3T3-E1细胞(
12 ]。我们首先检查EGCG PDGF-BB-stimulated il - 6的合成的影响。EGCG,仅对il - 6水平几乎没有影响,显著降低PDGF-BB-stimulated il - 6的合成(图
1 (a))。EGCG (30
μ 米)减少约50% PDGF-BB效应引起的。此外,我们还研究了EGCG primary-cultured老鼠成骨细胞的影响。PDGF-BB显著增强il - 6的合成主要成骨细胞(图
1 (b))。此外,EGCG (30
μ 米)显著降低PDBF-BB-stimulated il - 6的合成(图
1 (b))。我们接下来评估EGCG对细胞活力的影响通过台盼蓝染料排除测试。我们确认在37 MC3T3-E1细胞培养的可行性° C在24小时30
μ M EGCG相比超过90%的控制细胞。确定EGCG可能影响细胞增殖,我们计算细胞数量前后24小时孵化与30
μ M EGCG。我们证实,EGCG并不影响细胞数量的剂量30
μ 米(
9.7
±
1.1
×
10
5
细胞/毫升控制;
9.1
±
1.6
×
10
5
细胞/毫升30
μ M EGCG在刺激24小时)来衡量。因此,EGCG在30岁
μ 米几乎不影响细胞的生存能力或扩散osteoblast-like MC3T3-E1细胞24小时。
EGCG对PDGF-BB-stimulated il - 6合成的影响和表达水平的il - 6在成骨细胞信使rna。(一)Osteoblast-like MC3T3-E1细胞用不同剂量的EGCG预处理60分钟,然后由50 ng / mL PDGF-BB刺激或车辆24小时。每个值代表的意思
±
扫描电镜一式三份的决定。类似的结果有两个额外的和不同的细胞制剂。
P
*
<
0。
:相对于控制的价值。
P
*
*
<
0。
:相比PDGF-BB本身的价值。(b)的主要文化成骨细胞被使用或没有30
μ M EGCG的60分钟,然后由50 ng / mL PDGF-BB刺激或车辆24小时。每个值代表的意思
±
扫描电镜一式三份的决定。类似的结果有两个额外的和不同的细胞制剂。
P
*
<
0。
相比单独PDGF-BB价值。(c) Osteoblast-like MC3T3-E1细胞使用30
μ M EGCG或车辆为60分钟,然后刺激50 ng / mL PDGF-BB 60分钟。总RNA是孤立和转录成互补DNA。白介素mRNA的表达和GAPDH信使rna被实时rt - pcr量化。il - 6 mRNA水平正常化与GAPDH mRNA。结果标准化的价值控制(没有EGCG和PDGF-BB)。每个值代表的意思
±
扫描电镜一式三份的决定。类似的结果有两个额外的和不同的细胞制剂。
P
*
<
0。
:相对于控制的价值。
P
*
*
<
0。
:相比PDGF-BB本身的价值。
(一)
(b)
(c)
3.2。EGCG对骨钙素水平的影响,在MC3T3-E1-Cells Osteoprotegerin
接下来,确定EGCG影响这些细胞的分化,我们检查了EGCG对骨钙素的合成的影响,一个成熟的成骨细胞表型(
28 ],osteoprotegerin(功能),由成骨细胞和抑制监测骨吸收
29日 ),在MC3T3-E1细胞合成。我们发现EGCG对骨钙素没有影响(没有可检测的实验条件下,< 1.56 ng / mL)和功能(1967
±
34个pg / mL车辆;1846年
±
46个pg / mL 30
μ M EGCG)的合成。
3.3。EGCG对PDGF-BB-Induced表达的il - 6水平的影响在MC3T3-E1细胞信使rna
澄清是否抑制效应EGCG PDGF-BB-stimulated il - 6的合成是通过介导的转录事件或不是,我们检查了EGCG在PDGF-BB-induced il - 6的影响通过实时rt - pcr mRNA的表达。我们发现,EGCG (30
μ 米)显著下调白介素mRNA表达水平刺激(图后60分钟
1 (c)),这表明EGCG是介导的抑制效应至少在一定程度上降低il - 6的合成在osteoblast-like MC3T3-E1细胞。
3.4。效果的EGCG PDGF-BB-Induced PDGF受体的自身磷酸化<斜体>β< /斜体> MC3T3-E1细胞
为了澄清的抑制机制背后的EGCG PDGF-BB-stimulated il - 6在这些细胞合成,我们下一个检查EGCG的影响PDGF-BB-induced PDGF受体的自身磷酸化
β 。EGCG未能影响PDGF-BB-induced PDGF受体的自身磷酸化
β (图
2 )。这些结果让我们推测EGCG-effect PDGF-BB-stimulated il - 6的合成的机制可能是通过下游PDGF受体介导的激活。
图2
效果的EGCG PDGF-BB-induced PDGF受体的自身磷酸化
β 在MC3T3-E1细胞。培养细胞是用指定剂量的EGCG预处理或车辆60分钟,然后由50 ng / mL PDGF-BB刺激或车辆3分钟。细胞的提取受到sds - page和随后的免疫印迹分析抗体phospho-specific PDGF受体
β 或PDGF受体
β 。直方图显示的水平的定量表示PDGF-BB-induced自身磷酸化获得激光光密度分析的三个独立的实验。每个值代表的意思
±
扫描电镜一式三份的决定。类似的结果有两个额外的和不同的细胞制剂。
3.5。EGCG对PDGF-BB-Induced激酶磷酸化p44 /第42页地图,地图p38激酶或SAPK /物在MC3T3-E1细胞
在我们之前的研究
13 ),我们报道,PDGF-BB激酶激活三大地图,p44 /第42页MAP激酶,p38激酶,地图和SAPK /物,导致在MC3T3-E1细胞il - 6的合成。我们下一个检查EGCG的影响PDGF-BB-induced p44 /第42页MAP激酶的磷酸化,p38激酶地图,或SAPK /物。EGCG未能影响PDGF-BB-induced p44 /第42页MAP激酶的磷酸化或p38激酶(数字地图
3 (一)和
3 (b))。相反,EGCG,本身几乎没有影响的磷酸化水平SAPK /物,显著抑制PDGF-BB-induced SAPK /物磷酸化(图
4 )。根据光密度分析,EGCG (30
μ 米)引起PDGF-BB-effect减少约40%。
EGCG对p44 /第42页MAP激酶的磷酸化和p38 MAP激酶由PDGF-BB MC3T3-E1细胞。培养细胞是用指定剂量的EGCG预处理或车辆60分钟,然后由50 ng / mL PDGF-BB刺激或车辆3分钟。细胞的提取受到sds - page和随后的免疫印迹分析抗体(a) phospho-specific p44 /页MAP激酶激酶或p44 /页地图,和(b) phospho-specific p38 MAP激酶或p38激酶地图。直方图显示PDGF-BB-induced磷酸化水平的定量表示获得激光光密度分析的三个独立的实验。每个值代表的意思
±
扫描电镜一式三份的决定。类似的结果有两个额外的和不同的细胞制剂。
(一)
(b)
图4
EGCG对磷酸化SAPK /物诱导的PDGF-BB MC3T3-E1细胞。培养细胞是用指定剂量的EGCG预处理或车辆60分钟,然后由50 ng / mL PDGF-BB刺激或车辆3分钟。细胞的提取受到sds - page和随后的免疫印迹分析抗体phospho-specific SAPK /物或SAPK /物。直方图显示PDGF-BB-induced磷酸化水平的定量表示获得激光光密度分析的三个独立的实验。每个值代表的意思
±
扫描电镜一式三份的决定。类似的结果有两个额外的和不同的细胞制剂。
P
*
<
0。
:相比PDGF-BB本身的价值。
3.6。EGCG对PDGF-BB-Induced一种蛋白激酶的磷酸化或p70 S6激酶引起PDGF-BB MC3T3-E1细胞
在我们先前的研究[
12 ,
13 ),我们证明了PDGF-BB-activated Akt和p70 S6激酶限制MC3T3-E1细胞中il - 6的合成。为了调查是否EGCG-effect PDGF-BB-stimulated il - 6的合成是通过一种蛋白激酶的激活介导或p70 S6激酶在这些细胞中,我们检查了EGCG Akt的PDGF-BB-induced磷酸化的影响或p70 S6激酶。然而,EGCG对Akt PDGF-BB-induced磷酸化的影响很小(图
5 (一))或p70 S6激酶(图
5 (b))。
EGCG对一种蛋白激酶的磷酸化和p70 S6激酶引起PDGF-BB MC3T3-E1细胞。培养细胞是用指定剂量的EGCG预处理或车辆60分钟,然后由50 ng / mL PDGF-BB刺激或车辆20分钟。细胞的提取受到sds - page和随后的免疫印迹分析抗体(a) phospho-specific Akt或一种蛋白激酶,和(b) phospho-specific p70 S6激酶或p70 S6激酶。直方图显示PDGF-BB-induced磷酸化水平的定量表示获得激光光密度分析的三个独立的实验。每个值代表的意思
±
扫描电镜一式三份的决定。类似的结果有两个额外的和不同的细胞制剂。
(一)
(b)
4所示。讨论
在目前的研究中,我们表明,EGCG显著抑制PDGF-BB-stimulated il - 6的合成与表达的il - 6水平mRNA在osteoblast-like MC3T3-E1细胞。我们发现,EGCG也减少了PDGF-BB-stimulated il - 6的合成primary-cultured老鼠成骨细胞。这些发现表明,EGCG PDGF-BB-stimulated il - 6的合成的抑制作用不是特定的克隆osteoblast-like MC3T3-E1细胞但在成骨细胞是很常见的。我们证实,EGCG 30
μ 米几乎不影响细胞的生存能力或扩散osteoblast-like MC3T3-E1细胞24小时。至于EGCG对这些细胞的分化的影响,结果表明,EGCG对骨钙素没有影响功能和合成。然而,它已被证明,儿茶素刺激碱性磷酸酶活动,一个成熟的成骨细胞表型(
5 ),减少骨吸收细胞因子生产osteoblast-like MC3T3-E1细胞(
21 ]。考虑到这些结果,建议EGCG可以部分分化的影响osteoblast-like MC3T3-E1细胞。我们接下来研究的机理EGCG底层il - 6的合成的抑制作用。众所周知,MAP激酶总科中扮演着关键角色在细胞功能包括增殖、分化、和生存在各种细胞(
14 ]。三大地图激酶,p44 /第42页MAP激酶,p38激酶,地图和SAPK /物,被称为中央元素所使用的哺乳动物细胞转导多种消息(
14 ]。我们以前报道,SAPK /物作为积极的监管机构PDGF-BB-induced MC3T3-E1细胞中il - 6的合成(
13 ]。在目前的研究中,我们表明,EGCG并不影响PDGF-BB-induced p44 /第42页MAP激酶的磷酸化或p38激酶地图。因此,似乎不太可能,EGCG减少PDGF-BB-stimulated il - 6合成通过下调激活p44 /页MAP激酶或p38 MAP激酶osteoblast-like MC3T3-E1细胞。另一方面,我们表明,PDGF-BB-induced磷酸化SAPK /物被EGCG明显抑制。这些结果表明,EGCG会使PDGF-BB-stimulated激活SAPK /物。考虑到我们的发现,这是最有可能通过下调EGCG抑制PDGF-BB-stimulated il - 6的合成SAPK /物的活化osteoblast-like MC3T3-E1细胞。进一步的调查需要澄清的精确机制儿茶素的抑制il - 6在成骨细胞合成。
我们之前显示一种蛋白激酶和p70 S6激酶负调节的il - 6 PDGF-BB-stimulated合成osteoblast-like MC3T3-E1细胞(
12 ,
13 ]。我们另外Akt的参与调查和p70 S6激酶的抑制作用EGCG对il - 6的合成。然而,EGCG未能影响Akt的PDGF-BB-induced磷酸化或p70 S6激酶。因此,它似乎不太可能,EGCG抑制PDGF-BB-induced il - 6合成通过下调一种蛋白激酶的激活或p70 S6激酶在osteoblast-like MC3T3-E1细胞。考虑到我们的发现,这是最有可能通过下调EGCG抑制PDGF-BB-stimulated il - 6的合成SAPK /物的活化osteoblast-like MC3T3-E1细胞。
il - 6,成骨细胞合成,调节各种骨细胞功能(
3 ]。在骨代谢,il - 6分泌的成骨细胞作为自分泌/旁分泌因子,导致破骨细胞形成和激发其活性骨再吸收(
4 ,
7 ]。根据我们的结果,可能catechin-induced SAPJ /物激活的抑制PDGF-BB通过下调il - 6对骨吸收有抑制作用在成骨细胞合成。据报道,PDGF-BB被认为是一种潜在的刺激成骨细胞增殖和胶原蛋白的合成
30. ]。公布的PDGF在血小板聚集,一个关键的角色在骨折治疗系统性因素,这PDGF调节骨重塑当地因素(
30. ]。对于骨质疏松症的一个主要问题在发达国家老年人的健康,据报道,政府重组PDGF-BB加速骨折愈合在老年骨质疏松性大鼠(
31日 ]。然而,目前的研究表明,PDBG-BB刺激il - 6的合成,有效的骨吸收剂之一,不仅是osteoblast-like MC3T3-E1细胞也主要培养的成骨细胞。在目前的研究中,值得注意的,EGCG减少PDGF-BB-stimulated il - 6在成骨细胞合成。因此,我们目前的研究结果让我们推测,EGCG可能提高骨折愈合的属性PDGF-BB降低il - 6在成骨细胞合成。我们目前的数据将提供一个新的见解药理儿茶素对骨代谢的影响。
EGCG的药物在人类志愿者单剂量600毫克/天显示快速吸收,最大血浆浓度的值为11.08
μ 米(= 3392 ng / mL);时间达到最大血浆浓度为2.2小时,和终端消除半衰期时间介于1.9和4.6之间(
32 ]。有趣的是,10天重复政府的口服剂量的EGCG高达800毫克/天被发现是安全的和非常良好的耐受性
33 ]。在目前的研究中,我们表明,显著抑制EGCG对PDGF-BB-stimulated il - 6合成的影响显然是观察到10
μ m .因此,最有可能的是一个可以喝绿茶足以达到体内水平是用于我们的体外研究。此外,它已经表明,血浆浓度所需的EGCG癌症预防或抗炎作用是在10
μ 米到50
μ 米(
34 - - - - - -
36 ]。我们的研究结果,对于抑制il - 6的合成,与这些先前的发现一致。所知甚少的有效浓度EGCG才能调节胞内信号通路。进一步的调查使用primary-cultured成骨细胞除了MC3T3-E1将有必要阐明儿茶素的确切角色骨骼的新陈代谢。
总之,我们目前的研究结果有力地表明,儿茶素通过抑制抑制il - 6的合成PDGF-BB-stimulated SAPK /物造骨细胞的途径。