局部麻醉剂的软骨毒性：脂质体Bupivacaine少于标准的Bupivacaine少于毒性毒性

抽象的

客观的．本研究的目的是确定(1)脂质体布比卡因是否软骨毒性;(2)脂质体布比卡因的软骨毒性与标准布比卡因不同;（3）软骨毒性效应是依赖于时间。材料和方法．我们获得了来自12个新的牛远端股骨膝关节的72个10毫米关节软骨塞，并将其暴露于盐水，0.5％Bupivacaine或脂质体Bupivacaine以进行30或90分钟。治疗后二十四小时，使用荧光活/死导测量软骨细胞活力。进行ANOVA对方差的测试，然后进行HOLM-SIDAK测试，以使跨条件进行成对比较。学生t-test用于比较平均值。结果．暴露于脂质体Bupivacaine 30分钟的细胞的活力百分之少，与盐水对照（53.9％±21.5％与73.7±18.4％， ），并且在90分钟内保持显着意义（49.1％±20.3％与67.2％±25.6％， ）.与布比卡因相比，脂质体布比卡因在90分钟后的软骨毒性作用更小，生存能力更强(49.1%±20.3% vs. 21.4%±14.0%， ）.发现脑毒性是依赖于布比卡因组的时间（30分钟的活力百分比：45.5±18.2％，90分钟：21.4±14.0％， ）;然而，脂质体布比卡因并没有显示出明显的时间依赖性软骨毒性关系( ）.结论．布比卡因和脂质体布比卡因对软骨细胞均有毒性。脂质体布比卡因的软骨毒性比标准布比卡因小，且无时间依赖性毒性。

1.介绍

关节内注射局麻药通常用于处理与退行性关节疾病相关的疼痛，以及关节镜手术相关的疼痛。它们已被使用多年，并已被证明是有效的门诊设置诊断和治疗目的。围手术期给予关节内局麻药也被证明可以改善术后疼痛评分，减少阿片类药物消耗和阿片类药物相关的不良事件，如呼吸抑制、镇静和便秘[1］.对于关节内注射的并发症，特别是关节镜手术中涉及健康软骨的并发症，已经引起关注。研究人员发现，布比卡因和其他局部麻醉剂对软骨细胞是有毒的，体外和体内研究表明，即使是短暂的暴露也会导致软骨细胞代谢下降，软骨细胞凋亡和坏死增加，软骨形态学退化[2- - - - - -8］.疼痛泵模型显示持续暴露于局麻药输注后软骨大体坏死[9］.然而，局部麻醉剂之间的脑毒性程度随一些展示比其他人的脑毒性更大的情况5，9- - - - - -11］.

局部麻醉药注射到关节可以提供已知的止痛效果，因此，人们一直在寻找更少软骨毒性的配方。2011年10月，FDA批准了一种新型脂质体布比卡因配方。它由多泡脂质体组成，比标准布比卡因在更长的时间内缓慢释放布比卡因。脂质体布比卡因的半衰期约为34小时[1]与标准布比卡因的2.7小时相比。这允许手术或行走手术后持续疼痛缓解。本研究的目的是确定(1)脂质体布比卡因是否软骨毒性;(2)脂质体布比卡因的软骨毒性与标准布比卡因不同;（3）软骨毒性效应是依赖于时间。我们的零假设是脂质体Bupivacaine既不是肺毒素也不具有时间依赖性毒性。

2。材料和方法

我们采集了12只新鲜屠宰牛膝关节的关节软骨。当地屠宰场对肉牛实施安乐死的年龄一般在18个月左右。牛软骨是一种已被接受的体外软骨模型，并已在以前的局部麻醉研究中使用[3.，4，6］.我们使用燕麦收割机系统（Arthrex，那不勒斯，FL）并获得10毫米芯，从每个膝盖的远端股骨关节表面收获6个关节塞（每个髁上）总共72个核心。将插头保持在组织培养基中（Dulbecco改良的鹰培养基/ F12，10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素和1％鼠尾松），并在4小时内进行，使其暴露于实验处理。然后将插头随机分离成6组12个核心。然后将该组浸没在正常盐水中，1.3％未稀释的脂质体Bupivacaine（Exparel®，parirabermaceuticals，Parsippany，NJ，USA）或0.5％Bupivaine。选择脂质体Bupivacaine的浓度，因为这是市售浓度。标准配方Bupivacaine选择0.5％，因为这是常见的临床用浓度。此外，为了比较，其他研究使用这种浓度来研究Bupivacaine的核酸毒性[2- - - - - -4，7，9- - - - - -12］.三组插头(n = 12 each) were submerged for 30 minutes, and three groups of plugs were submerged for 90 minutes (Figure1）.

然后将塞子用正常盐水洗涤，然后将它们转移到新的组织培养基中。24小时后，我们使用了振动式切片机（颤抖，圣路易斯，莫，美国）获得100 μM厚切片从每个关节塞中的中间三分之一并垂直于关节表面定向。然后用5次染色每个切片 μm含5-氯甲基血管素蛋白酶（cmfda;分子探针，eugene，Or）和1.5 μM碘化丙在室温黑暗下浸泡30分钟。5-氯甲基荧光素二乙酸酯是一种市场上可买到的绿色荧光染料，它可以自由地通过细胞膜，在那里它被酶转化成一个不渗透的分子。然而，碘化丙啶是膜不透的，当与核酸结合时，它发出红色荧光，通常用于识别非活细胞。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗染色切片。使用Zeis Axio Observer z1 -倒LSM 710 NLO激光扫描共聚焦显微镜和水浸X63 C平面消色差(NA 1.2)物镜拍摄图像。图像为1.661 × 1.661μm和1024×1024像素，具有16位采样深度。使用不同的激光器来激发每种染料。用488nm激光激活5-cmfda，用561nm激光激活碘化丙锭。通过目视检查峰值荧光信号进行图像。使用公共领域Java图像处理程序（imagej;国家健康机构，Bethesda，MD，MD，MD，USA）进行了保存和分析图像。为了计算软骨细胞的数量，其他有软骨细胞和软骨细胞核的大小量化了[13］.我们在共聚焦显微镜下使用标准大小的小球来确定活的或死的软骨细胞或软骨细胞核的颗粒大小。然后我们使用直方图分析和粒径标准差来确定每个共聚焦图像上软骨细胞的数量，绿色为活细胞，红色为死细胞(图)2）.

进行ANOVA差异测试，然后进行HOLM-SIDAK测试，以使横跨条件进行成对比较，以比较软骨细胞的可存活率，用于不同的处理臂的装置。在团体中，学生t- 最低用于比较均值的可行性。结果呈现为活性软骨细胞（活力百分比）的百分比。

3.结果

与盐水控制相比，在30分钟内暴露于脂质体Bupivaine的塞子中的活力百分比较少（73.7±18.4％，53.9％±21.5％ ）.与生理盐水相比，脂质体布比卡因在90分钟时继续显示存活软骨细胞的统计学减少(49.1%±20.3% vs. 67.2%±25.6%)。 ）（桌子1）.与生理盐水相比，标准配方布比卡因在所有时间点均显示出显著的软骨毒性(见表)1）.

脂质体布比卡因在90分钟时的软骨毒性明显低于布比卡因(49.1%±20.3% vs. 21.4%±14.0%)。 ）.然而，与标准布比卡因相比，脂质体布比卡因在30分钟时间点的软骨细胞存活率没有显著差异(53.9%±21.5% vs. 45.5%±18.1%)。 ）.与盐水相比，标准制剂Bupivacaine在所有时间点显示出显着的肺毒性（表格1）.

布比卡因的软骨毒性是时间依赖性的，但脂质体布比卡因的软骨毒性没有达到统计学意义(图)3.）.脂质体布比卡因存活率在30分钟和90分钟之间没有差异(53.9%±21.5% vs. 49.1%±20.3%)。 ）.在30分钟后90分钟后，Bupivacaine软骨性更大（21.4％±14.0％与45.5％±18.1％后， ）.

4.讨论

我们研究的主要结果是确定脂质体布比卡因是否具有软骨毒性，是否比标准配方布比卡因具有更大的软骨毒性，以及软骨毒性是否具有时间依赖性。我们发现脂质体布比卡因实际上具有时间依赖性的软骨毒性，拒绝了我们的零假设。此外，脂质体布比卡因在90分钟时的软骨毒性低于布比卡因。

术后盂肱关节软骨溶解的报道引起了人们对局麻药潜在软骨毒性的关注[14，15］.之前的体外研究表明，Bupivacaine和Lidocaine可能是肺毒性的。最近介绍了一种新型的脂质体Bupivacaine的制剂，但是缺乏关于关节内脂质体Bupivacaine的安全性的数据。Shaw等人。在暴露于脂质体Bupivacaine，Bupivacaine和Ropivacaine之前，收获牛膝关节软骨和孤立的软骨细胞中的软骨细胞[16］.他们的结果显示，在脂质体布比卡因暴露1小时后，软骨细胞活力与对照组相似。脂质体布比卡因软骨细胞活力高于罗哌卡因和布比卡因。在他们的研究中，软骨细胞活力要大得多，这很可能是由于更高的基线细胞活力。他们只使用了首次传代软骨细胞，这表明这项研究是从一个更健康、更同质的人群开始的。与我们的研究相比，我们将关节栓塞而不是软骨细胞介质暴露于局麻药中，这可能更能代表体内暴露。相比之下，我们的研究显示脂质体布比卡因组软骨细胞的活力较对照组降低。此外，Shaw等人只在一个时间点报告了结果;因此，不能评估时间依赖性毒性。

Sridaran等人研究了脂质体布比卡因对人类软骨细胞的暴露[17］.他们从接受踝关节融合手术的成年患者中采集了宏观上正常的关节软骨，并将其暴露于乙醇中重悬的冻干布比卡因、不同配方的布比卡因、脂质体载体DepoFoam (Pacira)和脂质体布比卡因中。同样，他们发现与脂质体配方相比，布比卡因的生存能力下降。他们注意到脂质体布比卡因在6小时内的时间依赖性毒性。

我们的研究与先前发表的文献一致，证明脂质体布比卡因也是软骨毒性的，但这项研究有助于量化布比卡因脂质体对软骨细胞的毒性。以前的研究表明，所有的局麻药都在一定程度上具有软骨毒性[2，5，7，14］.然而，局麻药之间的软骨毒性程度存在显著差异，因此研究一种新配方对于确定软骨毒性程度和进一步了解毒性的时间依赖性具有重要价值。

然而，脂质体布比卡因在90分钟后的毒性小于标准布比卡因制剂。脂质体布比卡因比标准布比卡因(36:3.5)具有更低的峰值浓度(1:6)，更长的到达峰值浓度的时间(1:12)和更长的半衰期，因此其软骨毒性较小[1］.在接头中浓度较长的时间较长一段时间，对于延长的疼痛缓解，必须称重软骨细胞毒性的风险。这些数据表明脂质体Bupivacaine可能是关节内注射的更好的选择，而不是Bupivacaine，提供更长的疼痛缓解，随着时间的推移，细胞毒性较少。

我们的研究表明，标准配方Bupivaine对关节软骨的影响继续暴露的时间。Bupivacaine在90分钟时更加肺癌毒性比30分钟更高。这种同意先前发表的研究，该研究表明了局部麻醉剂的时间依赖性软骨毒性，包括利多卡因，布比卡因和罗哌卡因以及类固醇[6，10，12］.有趣的是，脂质体布比卡因在90和30分钟的软骨毒性没有显著差异。脂质体配方可通过其药代动力学差异提供时间依赖性的保护。

Ropivacaine是另一种长效的局部麻醉剂，具有与Bupivacaine相似的活性持续时间[18］.罗哌卡因的文献是Chondrotoxicty的变化，一些研究显示，在人软骨细胞孵育30分钟后显示没有毒毒性[7或12小时[5］.其他研究表明，在较高浓度的0.75％的浓度下表现出软毒性[19］.Shaw比较了罗哌卡因和脂质体布比卡因，发现脂质体组软骨细胞活力更高[16］.

这项研究有几个限制。我们的研究是在体外进行的，并且观察结果不能直接施用体内;因此，所有结果都需要在临床上进行确认。我们的研究使用牛软骨而不是人类软骨，因此从本研究中得出的结论可能或可能不适用于人类。然而，对该受试者的许多研究已经在牛软骨上进行了[3.，4，6，14］.

我们使用了每种实验药剂的一种浓度和两个时间点，因此我们的研究结果可能难以应用于体内条件，因为在关节中存在潜在的稀释效应。我们没有直接评估脂质体布比卡因实验溶液中游离布比卡因的浓度。由于脂质体在体内外的溶出取决于pH、体积、血管状况等多种因素，布比卡因的扩散是不可能控制的。因此，我们试图在体外模拟布比卡因的体内环境，研究布比卡因的自发扩散。更长的潜伏期是理想的;然而，这项研究的体外性质存在固有的局限性。软骨是从活的动物身上移植下来的，因此细胞变得越来越脆弱，对任何实验制剂的敏感性也越来越高。我们怀疑，由于体外模型中软骨细胞的自然降解，我们将在更长的时间间隔内获得混杂数据。90分钟的时间点也是根据之前发表的多个时间点潜伏期的研究选择的[6，10］.潜在的未来研究可能是考虑更长的时间点和对这些相同配方的软骨的影响。

脂质体组中使用的基于脂质的贮库（Depofoam）由多产脂质体组成，具有非浓度的多脂层[20.］.这种结构被认为可以增加药物的稳定性和延长药物释放时间。而在没有药物的情况下，分离的脂质库可以作为适当的控制，但无法进行检测。然而，基质的基本结构阻止基质与软骨膜相互作用或进入细胞。因此，生理盐水被认为是一种合适的替代控制介质，试图匹配体内环境。

然而，与之前发表的研究相比，我们认为我们的研究有几个优点。首先，我们的研究使用关节软骨的骨软骨核。以前有研究关注完整的软骨基质和分离的软骨细胞的价值，因为关节表面作为药物的天然屏障，因此是一个更可靠的模型。其次，我们采用了与之前研究相似的方案，这增加了我们研究方法的有效性，也便于与之前的研究进行比较。虽然额外的麻醉剂可以用来与脂质体布比卡因进行比较，但通过只比较标准配方布比卡因，我们已经能够仅基于脂质体配方来识别差异。

5.结论

与其他麻醉剂类似，脂质体布比卡因对软骨细胞有毒;然而，与标准布比卡因相比，它的软骨毒性更小，而且由于时间依赖性的毒性更小，在关节内镇痛时可能更安全。暴露时间及其影响的临床相关性尚不清楚，对特定剂量和时间依赖性影响的进一步研究是有必要的。

数据可用性

用于支持本研究结果的可存活率数据可根据要求提供。

披露

作者进行了这项研究，作为洛马林达大学矫形外科的作者雇佣的一部分。

的利益冲突

(1)作者个人利益声明:(i) Nirav Amin，医学博士，曾担任Pacira Pharmaceuticals的发言人、顾问和顾问委员会成员，并获得Pacira Pharmaceuticals的研究资助。Nirav Amin医学博士拥有Pacira制药公司的股票和股份。(2)所有其他作者声明没有潜在的利益冲突。

致谢

成像在洛马琳达大学医学院进行了先进的成像和显微镜核心，并支持NSF（Grant No。MRI-DBI 0923559）（SM Wilson）和Loma Linda大学医学院。我们想承认Monica Rubalcava，为她的软骨细胞成像提供帮助。

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