IR-6：一种新型铱星（III）有机金属衍生物，用于抑制人血小板活化

摘要

据报道，血小板活化在动脉血栓形成，癌症转移和进展中发挥着重要作用。最近，我们开发了一种新的IR（III）基本的化合物[IR（CP3 - (1 - (2-pyridyl) 4-dimethylaminophenyl)咪唑并[1 5]吡啶Cl)的男朋友_4.或IR-6并评估其作为抗血小板药物的有效性。IR-6对胶原蛋白刺激的人血小板聚集表现出更高的效力。IR-6还抑制ATP释放，细胞内CA²⁺动员，p-选择素表达，以及磷脂酶C的磷酸化γ.2 (PLC)γ.2），蛋白激酶C（PKC），V-Akt的鼠胸腺瘤病毒致癌基因（AKT）/蛋白激酶B，和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），胶原蛋白激活的血小板。无论是腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536也不鸟苷酸环化酶抑制剂1H- [1,2,4]恶二唑并[4,3-a]喹喔-1-酮显著逆转胶原诱导的血小板聚集的IR-6介导的抑制。此外，IR-6没有显着地减弱在胶原活化的血小板或芬顿反应溶液OH自由基的信号。At 2 mg/kg, Ir-6 markedly prolonged the bleeding time in experimental mice. In conclusion, Ir-6 plays a crucial role by inhibiting platelet activation through the inhibition of signaling pathways, such as the PLCγ.2-PKC级联和随后抑制AKT和MAPK激活，从而最终抑制血小板聚集。因此，IR-6是用于预防或治疗血栓栓塞或破坏血小板和肿瘤细胞之间的相互作用的潜在治疗剂，这有助于肿瘤细胞生长和进展。

1.介绍

血小板是一种无核血细胞，在生理和病理条件下都在血栓形成中发挥重要作用。它们是维持血管系统完整所必需的，也是防止出血的第一道防线。当遇到血管损伤暴露的内皮下基质时，血小板粘附在基质上并被激活并粘附到其他血小板上，导致进一步聚集[1］．在血小板活化期间，释放几种介质（例如，ATP和血栓素A.₂）与相对的细胞内Ca同时发生²⁺([Ca²⁺]_一世）动员，吸引额外的血小板到受伤内皮的部位，因此加厚初始血小板单层。最后，纤维蛋白原与其特定的血小板受体结合，完成了血小板聚集的最终常见途径。

血小板及其激活是关键事件，在癌症进展中发挥着关键作用[2那3.］．血小板对恶性肿瘤发展的影响已经被提出是一个可控的过程，触发癌症的增长。因此，抑制血小板聚集有望成为减少血小板-肿瘤复合物形成的新的治疗靶点[4.］．过渡金属配合物，包括那些铱（Ir），已探索了至少十年作为用于与抗癌性质生产创新分子平台。尽管一些生物的研究表明，基于IR的化合物表现出相对较少的副作用，有效的抗癌活性，没有研究调查了血小板聚集迄今为止铱化合物的效果。

近年来，研究人员在IR（III）化合物上获得了更多的注意，因为它们发现强大的抗肿瘤活性，朝向正常组织的低细胞毒性[5.那6.］．同样地，红外复合物通过激活各种抗血管生成信号通路来显示出优异的抗血管生成效果[5.］．在我们之前的研究中，我们已经表明苯酚[7.]和苯甲醚[8.]取代的咪唑并[1,5-a]吡啶基于配体的铱（III）配合物和它们的抗血小板和抗血栓形成活性。在电子给体的作用这些研究对咪唑并延续并[1,5-a]吡啶基配体，我们引入了二甲基苯胺作为强电子供体基团和研究了它的抗血小板活性。此外，我们开发了一种新的生物活性的Ir（III），如图衍生物的Ir-61（a）．此外，先前的研究报道了含有发光配体的IR（III） - 环状复合物的光学和光化学性质[9.］．因此，我们使用相同的配体来合成IR-6复合物[IR（CP）1-（2-吡啶基）-3-（4-二甲氨基苯基）咪唑并[1,5-a]吡啶CL] BF4执行本研究。尽管一些在体外和体内抗癌活性已经证明，在基于IR的化合物，迄今为止，还没有研究研究了它们对血小板聚集的效果。我们的初步调查结果显示铱6人血小板的强效抗血小板活性;因此，我们进一步研究的Ir-6的对血小板活化的分子机制和活性。本研究是用于研究的主要步骤的Ir-6的针对癌症进展的有效活性是否是由于它能够抑制血小板聚集有效。

2.材料和方法

2.1。化学品

凝血酶，胶原蛋白，花生素酸（AA），Luciferin-Luciferase，U46619，Phorbol 12,13-二丁酸盐（PDBU），硝基甘油（NTG），肝素，前列腺素E.₁（PGE.₁)、5,5-二甲基-1-吡咯啉n-氧化物(DMPO)、SQ22536、1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ)、LY294002、SB203580、PD98059、SP600125和牛血清白蛋白(BSA)均购自Sigma (St. Louis, MO, USA)。Fura-2AM购自Molecular Probes公司(Eugene, OR, USA)。抗磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) Ser^182.单克隆抗体（MAB）购自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。抗P38 MAPK，抗磷酸-C-JUN N-末端激酶（JNK）（THR^183./ Tyr.^185.），抗P44 / 42细胞外信号调节激酶（ERK）mAb以及抗磷脂酶C.γ.2 (PLC)γ.2），抗磷酸（酪氨酸^759.）PLCγ.2，抗磷酸 - （Ser）蛋白激酶C（PKC）底物（PLECKSTRIN; P-P47），抗JNK和抗磷酸-P44 / P42 ERK（THR^202./ Tyr.^204.）多克隆抗体（PAB）购自电池信号（贝弗利，MA，USA）。抗磷蛋白激酶B（AKT）（SER^473.）和抗Akt单克隆抗体购自Biovision所属（山景，CA，USA）购买。抗普列克底物（P47）的pAb从GeneTex（尔湾，CA，USA）购买。的Hybond-P聚偏二氟乙烯（PVDF）膜辣根过氧化物酶（HRP-）缀合的驴抗 - 兔免疫球蛋白G（IgG）和绵羊抗 - 小鼠IgG来自Amersham（白金汉郡，UK）购得。异硫氰酸荧光素（FITC）抗人CD42P（P-选择素）单克隆抗体来自Biolegend公司（圣地亚哥，CA，USA）购买。

2.2。物[Ir（Cp的合成（l）cl] bf_4.（IR-6）

10ml 10ml的1-（2-吡啶基）-3-（4-二甲基氨基苯基）咪唑[1,5-a]吡啶（L）（0.12g，0.4mm）的甲醇溶液[9.]，[铱（Cp的溶液）（cl）₂]₂滴加10ml甲醇(0.16 g, 0.2 mM)，室温搅拌3h。随后,NH_4.BF._4.（将200mg，0.6mm）加入到溶液中，溶液从浅黄色到橙色缓慢地改变颜色。24小时后，蒸发溶液，过滤得到的固体。将残余物用乙醚（40mL）洗涤并在真空下干燥。所需产物从二氯甲烷和己烷的混合物中重结晶，作为橙色微晶。¹H NMR（400MHz，二甲基亚砜[DMSO] -D6）δ.8.86 - -8.84 (D.1 h,），8.50-8.44（m，2h），8.21-8.18（T.1 h,），8.01-7.99（D.2 h,），7.59-7.49（m，2H），7.19-7.16（T.1 h,），7.03-7.01（D.2 h,），3.6（S.，15h），1.36（S.，6h）;UV-Vis（λ._ABS，nm）（ε.，M.^-1·厘米^-1）：400（1447），304（2576），242（1468）;ESI-MS（M / Z）：677.17 [M-BF_4.]⁺（数字1（a））。

２.３.血小板聚集

台北医科大学（TMU-JIRB-N201612050），台湾的机构审查委员会批准了这项研究，并符合赫尔辛基宣言的指令。所有参与本研究的人类志愿者都提供了知情同意。如前所述制备人血小板悬浮液[10.］．人类血液样本来自谁没有采取任何能够与收集样品之前测试了至少14天影响任何药物或物质的成年志愿者收集的;采集的血液用酸 - 柠檬酸盐 - 葡萄糖溶液混合。离心后，将富含血小板的血浆（PRP）中的溶液中添加0.5 M PGE.₁和6.4 IU / ml肝素。使用含有3.5mg / ml BSA的Tyrode的溶液制备洗涤的人血小板的最终悬浮液。最终的加利福尼亚州²⁺Tyrode溶液中的浓度为1mm。使用Lumggregometer（Payton Associates，Scarborough，Canada）评估血小板聚集，如前所述[10.］．血小板悬浮液（3.6×10^8.cells/mL) preincubated with various concentrations of Ir-6 or a solvent control (0.1% DMSO) for 3 min before the addition of various agonists (i.e., collagen). The extent of platelet aggregation was calculated and expressed as a percentage relative to the control (without Ir-6) in light transmission units. In the ATP-release assay, a 20 在加入激动剂之前，在1分钟内加入Luciferin-leuciferase的L;将ATP释放量与控制血小板释放的释放量进行了比较。

2.4。测量[CA²⁺]_一世动员

(Ca²⁺]_一世如前所述使用FURA-2AM测定浓度[10.］．简而言之，将柠檬酸的全血以120×g离心10分钟，收集上清液并与5孵育 m fura-凌晨2点1小时。如前一节所述制备人血小板悬浮液。在1mM CaCl存在下用IR-6洗涤呋喃 - 2AM加载的血小板并用IR-6预孵育₂和胶原刺激。Fura-2 fluorescence was measured using a spectrofluorometer (Hitachi FL Spectrophotometer F-4500, Tokyo, Japan) at excitation wavelengths of 340 and 380 nm and an emission wavelength of 510 nm.

2.5。检测乳酸脱氢酶（LDH）

To detect the LDH activity, washed human platelets (3.6 × 10^8.细胞/ mL）用20-100预孵育 M IR-6或溶剂对照（0.1％DMSO）在37℃下20分钟。上清液等分试样（10 µL)置于富士drim - chem载片LDH-PIII (Fuji, Tokyo, Japan)上，在540 nm处用紫外-可见分光光度计(UV-160;日本岛津公司、日本)。超声检测血小板LDH最大值(MAX)。

2.6。通过流式细胞仪血小板表面P-选择素表达分析

这一分析，如先前所描述，制备洗过的血小板悬浮液[8.］．Aliquots of the platelet suspensions (3.6 × 10^8.il -6(10和20µM)或溶剂控制(0.1% DMSO)和fitc - p -选择素(2µg / ml）3分钟。胶原蛋白(1µg/mL)触发血小板活化。然后用流式细胞仪(FAC扫描系统，Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)检测悬浮液中荧光素标记的血小板。每个实验组采集50,000个血小板数据，并根据其正向和正交光散射特性对血小板进行区分。所有实验均至少重复4次，以确保重现性。

2.7。免疫印迹

免疫印迹分析:洗涤血小板(1.2 × 10^9.il -6(10和20µM）或溶剂对照（0.1％DMSO）3分钟，然后加入胶原蛋白以触发血小板活化。10分钟后，通过添加EDTA停止反应，并将所得血小板重新悬浮于200 l裂解缓冲液。蛋白质（约80个 g)在12%凝胶上通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。利用Bio-Rad半干燥转移装置(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。在Tween 20 (TBST;10 mM Tris-base, 100 mM NaCl, 0.01% Tween 20)含5% BSA孵育1 h，然后使用各种一抗进行检测。随后用酶标抗小鼠IgG或抗兔IgG (TBST稀释1:3000)孵育膜1小时。使用增强化学发光系统检测免疫反应条带，并使用bio - profile Biolight(版本V2000.01;Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée，法国)。

2.8。电子自旋共振光谱法检测血小板和芬顿反应溶液中OH·自由基的形成

电子自旋共振(ESR)光谱分析(Bruker EMX ESR, Billerica, MA, USA)如前所述进行[11.］．血小板悬液(3.6 × 10^8.细胞/ ml）或FENTON反应溶液（50 中号硫酸亚铁_4. + 2 mM H₂O.₂0.1% DMSO或Ir-6(10和20m）3分钟，有或没有添加1 g / ml胶原蛋白。After 5 min, 100 在ESR光谱测定前，在悬浮液中加入M DMPO。ESR光谱信号是用专为水溶液设计的石英平板电池记录的。该光谱仪工作在20 mW和9.78 GHz，扫描范围为100 G，接收增益为5 × 10^4.．The modulation amplitude was 1 G, and the time constant was 164 ms. Each sample was scanned for 42 s, and each spectrum was the sum of three scans.

2.9。小鼠尾出血时间测定

为了研究的Ir-6是否有出血风险，通过在雄性ICR小鼠尾部横切进行出血时间测定。To this, after 30 min of intraperitoneal administration of Ir-6 (1 or 2 mg/kg), the tails of mice were cut at a 3 mm distance from the tip. The tails were directly placed in tubes filled with normal saline at 37°C to measure the bleeding time, which was recorded until the bleeding completely stopped. The animal experiments were conformed to the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th edition, 2011) and obtained an affidavit of approval for animal use from Taipei Medical University (LAC-2016-0395), Taiwan.

2.10。统计分析

The experimental results are expressed as the mean ± standard error of the means (S.E.M.) and are accompanied by the number of observations (）。价值参考实验的数量，使用不同的献血者进行每个实验。未配对的学生T.-test用于测定的对照和实验小鼠之间差异的显着。在其他实验中的多个组之间的差异是通过方差分析（ANOVA）评估。当ANOVA表示的基团中的装置显著差异，组分别使用Student-纽曼-Keuls法进行比较。在分析中，值<0.05被认为是统计学意义的。使用SAS进行统计分析（第9.2版; SAS Inc.，Cary，NC，USA）进行。

3.结果

3.1。IR-6对洗涤人血小板血小板聚集的影响

如图所示1（b）和1（c），IR-6的预处理（5-20 M）强烈和在洗涤的人血小板浓度依赖性地抑制胶原诱导的聚集。响应于120 µΜ AA刺激，Ir-6在50-200时也逐渐抑制血小板聚集此外，在100-500 M、Ir-6对0.01 U/mL凝血酶或1µμU46619，前列腺内氧化氧化物类似物;结果表明，IR-6对胶原诱导的聚集具有更有效的活性。T.由其他激动剂AA，凝血酶和U46619诱导（图1（c））。所使用的溶剂对照（0.1％DMSO）没有影响不祥的血小板聚集。在随后的实验中，1 G / ML胶原蛋白用作激动剂，用于研究IR-6抑制人血小板活化的可能机制。

３．２．Ir-6抑制ATP释放²⁺]_一世动员和表面p -选择素的表达

血小板激活与粒状内容的释放相连，例如ATP和CA²⁺和表面p-选择素表达，导致强血小板聚集。在本研究中，IR-6（10和20 µM）抑制ATP释放反应刺激的由1 g / ml胶原蛋白（图2(一个)）。胶原可以刺激的[Ca²⁺]_一世通过促进CA的条目²⁺成从两个资源胞质溶胶;加利福尼亚州²⁺从细胞内储存释放并进入跨细胞膜的血小板。数字2 (b)， (A)显示胶原蛋白无1mm CaCl反应₂．在此条件下，钙的流入预计将显着减少，并且在内[Ca因此任何变化²⁺]_一世可以归因于从细胞内储存进入细胞质。用IL-6预处理（10和20 M）相对明显降低的[Ca²⁺]_一世在无钙Tyrode’s溶液中(静息控制，26.5±4.3 nM;胶原刺激，119.1±19.5 nM;10M Ir-6, 67.3 ± 7.3 nM; and 20 M IR-6,25.8±7.4 nm;),图2 (b)那(A) and in Tyrode’s solution (resting control, 139.4 ± 22.4 nM; collagen-stimulated, 626.8 ± 102.6 nM; 10 M IR-6,354.3±38.7 nm;和20 M IR-6,135.6±38.7 nm;),图2 (b)（b）在血小板中刺激1 g / ml胶原蛋白。此外，在静态（休息）血小板中，P-Selectin位于内壁上α.-Granules。血小板激活将颗粒的内壁暴露于细胞外部[12.］．IR-6处理在图的右侧面板显着降低胶原诱导的表面P-选择素表达，这表现在统计数据2 (c)(resting control, 55.7 ± 21.7; collagen-activated, 645.0 ± 148.9; 10 M IR-6,250.7±82.0;20. M Ir-6, 136.0 ± 39.7;）。

3.3。IR-6对循环核苷酸形成和LDH释放在洗涤的人血小板中的影响

两者都是100. M SQ22536，腺苷酸环化酶抑制剂和10中号ODQ，鸟苷酸环化酶抑制剂，显著逆转胶原诱导的血小板凝集的由1介导的抑制 M PGE.₁或10. 中号NTG（图3（a））。然而，无论是SQ22536也不ODQ显著逆转胶原诱导的血小板凝集的由20介导的抑制 M Ir-6(图3（a）），表明，IR-6介导的血小板聚集的抑制的机制不涉及循环核苷酸合成的增强。此外，血小板的聚集曲线预孵育100 M Ir-6孵育10分钟，随后用Tyrode的溶液洗涤两次，与在相同条件下用0.1% DMSO的溶剂进行预孵育的血小板没有显著差异(图)3（c））。该发现表明IR-6对血小板聚集的影响是可逆的，非单胞毒性毒性。此外，LDH释放结果表明，用IR-6（20,50和100，孵育血小板20分钟 M）没有显著增加LDH活性或对血小板表现出细胞毒性作用（图3（b）），证明IR-6不会影响血小板渗透性或诱导血小板细胞分解。

3.4。IR-6在调节PLC上的活动γ.2-PKC信令和AKT激活

PLCs水解磷脂酰肌醇4,5-双磷酸盐，产生次磷酸肌醇1,4,5-三磷酸（IP_3.）和二酰基甘油（DAG）。IP._3.触发相对(Ca²⁺]_一世动员，而DAG激活PKC。PKC activation yields a protein, approximately 47 kDa in size, that is predominantly phosphorylated (p47 protein; pleckstrin) and causes the ATP-release reaction [13.］．如图所示4（a），用10或20处理血小板 µM IR-6没有显着抑制150nm PDBU，PKC活化剂诱导的聚集（图4（a）），表明的Ir-6不直接破坏PKC激活。数字3（a）和3（b）图示了IR-6对ATP释放和相对[CA的抑制作用²⁺]_一世胶原蛋白诱导的动员。因此，我们进一步研究了IR-6对PLC磷酸化的影响γ.2-PKC信号级联。在10和20 µ男，铱6显着减少PLCγ.胶原蛋白刺激血小板的磷酸化以及PKC活化(pleckstrin磷酸化)(图2)4（b）和4（c））。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，其在各种细胞过程中起关键作用，例如血小板活化，细胞增殖，细胞凋亡和细胞迁移[14.］．既LY294002（Akt的抑制剂; 10 µm）和IR-6（10和20 µm）显着抑制胶原蛋白诱导的akt磷酸化（图4（d）），展示抑制AKT信号通路在IR-6介导的血小板活化抑制中的关键作用。

3.5。IR-6对抑制p38 Mapk，ERK2和JNK1磷酸化的影响

的MAPK磷酸化途径中的几个信号分子进行了评价研究的Ir-6的血小板活化的抑制机制。在真核生物的MAPK（p38蛋白，的ERKs，和JNKs信号）控制主要的细胞反应，并有助于细胞增殖，迁移，分化和凋亡的各种事件。的ERK，JNK1和p38 MAPK已在血小板[被确定15.］．SB203580（P38 MAPK的抑制剂; 10 µM），PD98059（ERK2的抑制剂; 20 µm）和SP600125（JNK1的抑制剂; 10 µM）显着抑制p38蛋白（图5（a）), ERK2(图5（b）)和JNK1(图5（c））胶原活化血小板中的磷酸化。IR-6以浓度依赖性方式降低了这三种蛋白质的磷酸化。尽管如此，在10 µM，IR-6无情地抑制P38 Mapk磷酸化（图5.）。

3.6。OH·IR-6介导的血小板聚集抑制的作用

ESR信号E.OH的·在两个胶原 - 刺激的血小板悬浮液和芬顿反应溶液（无细胞系统中观察到自由基形成;图6（a）和6（b））。典型的OH·信号（一种^N = 一种^H= 14.8 G)和长寿命(通过使用DMPO，自旋捕捉，）基团可检测胶原蛋白刺激的血小板中观察到，但在静止的血小板（图中未检测到6（a）），曲线（A）。治疗10或20 M IR-6在胶原蛋白和Fenton反应溶液激活的血小板悬浮液中没有大大减少OH信号（图6（a）和6（b）)，提示ir -6介导的抑制血小板活化可能不受自由基形成的调节。

3.7。铱-6对出血时间的影响

在小鼠的尾部转育模型中，在30分钟后，用腹膜内给药220mg / kg IR-6处理的小鼠中出血时间明显延长（323.3±55.2秒;），但没有在1.0 mg / kg治疗的那些（184.3±39.7 s;0.1% dmso处理组150.5±11.9 s;)(图6（c））。Each mouse was monitored whether there was any rebleeding 10 min after the original bleeding stopped.

4。讨论

血小板激活有助于癌症患者血栓形成事件的主要作用[16.］．化疗药物的方法可能增加这种效应，刺激通过诱导血小板聚集，内皮加重损伤，并引起血管毒性[血管血栓栓塞事件（乡镇企业）17.］．在以铂(Pt-)为基础的化疗药物中，顺铂被广泛应用于高发生率的治疗相关静脉血栓栓塞[18.］．吉西他滨联合pt治疗增加血栓和血管副作用[19.那20.］．因此，研究目前正在专注于开发新的金属类药物，用于抑制血小板活化以治疗血管疾病，降低毒性副作用，克服PT抗性。值得注意的是，该研究证明，除了其抗肿瘤活性，IR-6，IR-6，IR（III）衍生物表现出效率的抗血小板活性。

血小板粘附到替代血小板形状的前提下基质蛋白（例如胶原蛋白）并导致释放其颗粒状内容物。胶原蛋白动员[加利福尼亚州²⁺]_一世使钙磷酸化²⁺/钙调蛋白依赖性肌球蛋白轻链（20kDa），其参与粒状内容物的分泌，例如血清素和ATP [21.]，激活血小板聚集。因此，抑制[CA²⁺]_一世动员或ATP的产生对于评估化合物抗血小板活性的效力是至关重要的。在本研究中，Ir-6不同程度地抑制血小板聚集，这取决于用于诱导聚集的激动剂(胶原蛋白、U46619、AA和凝血酶)，表明Ir-6不作用于这些激动剂的特定个体受体。因此，Ir-6可能通过一个或多个常见的信号通路对激活的血小板发挥作用。

胶原蛋白激活的血小板实质上改变了PLC的激活。PLC增产可促进IP的生产_3.和DAG。随后，DAG激活PKC，并因此诱导P47磷酸化13.］．PKC激活触发器特异性应答简化在个体的细胞区室特定上行信号的传输。该PLCγ.家庭包括Isozymes PLCγ.1和PLCγ.2;PLC.γ.2参与胶原蛋白依赖性信号血小板[22.］．IR-6明显减少了胶原蛋白诱导的PLCγ.2-PKC激活;然而，Ir-6并不直接影响PKC的激活，因为它不干扰pdbu诱导的血小板聚集。这一发现表明，ir -6介导的血小板活化抑制涉及PLCγ.2下游信号传导。这一结果也可以解释为什么的Ir-6抑制血小板活化诱导胶原比在抑制诱发由其它激动剂表现出更高的功效。

人血小板激活通过环AMP (cAMP)和环GMP (cGMP)介导的细胞内途径抑制，因此这些核苷酸被认为是血小板激活的关键调节剂[23.］．循环核苷酸抑制大部分血小板响应并减少[CA.²⁺]_一世通过提高Ca水平²⁺吸收，从而抑制PLC和PKC激活[23.］．因此，cAMP和cGMP协同抑制血小板活化。此外，SQ22536和ODQ均未显著逆转ir -6介导的对胶原诱导血小板聚集的抑制。因此，ir -6介导的机制不涉及血小板中环核苷酸合成的增强。

据报道，AKT，普通磷酸二氢酶（PI3K）的下游效应器显示出在小鼠中缺失的激动剂诱导的血小板活化中的缺陷，这倡导AKT标准化血小板活化;这种调节可能对血栓形成有影响[14.那24.］．因此，Akt亚型，如个人PI3K亚型的特异性抑制剂，可能是有吸引力的抗血栓形成治疗的靶[14.］．细胞溶质磷脂酶A.₂(cPLA₂）是由von Willebrand因子（VWF）和凝血酶等激动剂诱导的p38 mapk活性的底物。25.］．因此，P38 MAPK对于CPLA至关重要₂刺激和AA释放[26.］．该观察结果可以解释为什么IR-6在抑制P38 MAPK激活以及凝血酶或AA刺激的血小板聚集中具有较弱的活性。ERK的激活也是血小板聚集的重要事件，需要先前的ATP释放，其激活p₂X₁- 导明的CA.²⁺内流，从而增强肌球蛋白轻链激酶的磷酸化[25.］．JNK1，另一种最近在血小板中发现的MAPK;因此，人们对其激活和作用知之甚少。一些激动剂，如凝血酶、vWF、胶原蛋白和ADP [23.激活JNK1。此外，先前的研究证实出血时间增加，整合素减少α._IIbβ_3.而JNK颗粒分泌严重受损^{- / -}血小板[27.］．因此，抑制JNK磷酸化可能在血小板活化中起关键作用。与这些结果一致的是，目前的结果表明，Ir-6可以显著抑制胶原蛋白诱导的JNK1磷酸化。

反应性氧物质（过氧化氢）和自由基物质（即，OH·）作为参与血小板活化的二次信号[28.］．在目前的研究中，我们的ESR光谱法研究提供了直接的证据证明的Ir-6不显著影响OH·形成在两个活化的血小板和芬顿反应溶液中。在铱6处理的实验小鼠中观察到止血的血小板栓形成（出血时间）的延长。出血时间观察结果表明，出血时间在人类的延长并不能预测出血或手术出血的风险。这些结果质疑使用出血时间为抗血小板化合物的临床评价[背后的基本原理29.］．

结论

总之，目前的研究结果表明，IR-6是一种新型铱星（III）化合物，通过防止信号分子（例如PLC）抑制血小板活化γ.2-PKC，随后抑制AKT和JNK1激活。这些改变抑制了与ATP释放相关的过程[CA.²⁺]_一世动员，表面p-选择蛋白表达，最终抑制血小板聚集。然而，需要额外的研究来研究IR-6介导的血小板活化抑制的其他身份不明机制。然而，IR-6可用作癌症治疗中的化学治疗剂。此外，它可以用作治疗血栓栓塞病症或破坏有助于肿瘤细胞生长和进展的血小板和肿瘤细胞之间的相互作用的抗血小板剂。

利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

作者的贡献

Ren-Shi Shyu、Themmila Khamrang和Joen-Rong shu对本文贡献相同。

致谢

这项工作是由来自台湾的科学和技术部资助（MOST 104-2622-B-038-003，MOST 104-2320-B-038-045-MY2，MOST 106-2320-B-038-012支持），国泰综合医院（CGH-MR-A106020），国泰综合医院，台北医学大学（107CGH-TMU-07），及大学教育资助委员会，印度（MRP-MAJOR-CHEM-2013-5144;2014分之69˚F。不10-11 / 12UGC）。

参考

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