Boswellia dalzielii.-介导的银纳米颗粒通过诱导细胞周期阻滞抑制急性髓系白血病(AML) Kasumi-1细胞

摘要

背景．急性髓性白血病（AML）仍然存在一个主要的健康问题，特别是儿童作为有效化疗，以便打击该疾病。Boswellia dalzielii.是一种众所周知的草药，传统上用于治疗和管理许多疾病，包括退行性疾病。在本研究中，银纳米粒子由植物化学物质合成B. Dalzielii.茎皮水提取物。通过傅里叶红外光谱(FTIR)、能量过滤扫描电子显微镜(FESEM)、x射线衍射和动态光散射(DLS)分析对银纳米颗粒进行了表征。采用2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)法评价纳米粒子的抗氧化能力，采用PrestoBlue法研究纳米粒子对kasami -1白血病细胞的抗增殖作用。采用流式细胞术观察纳米颗粒对白血病细胞周期进展的影响。结果．我们的发现表明，合成的银纳米颗粒由植物植物化学物质的电子形成，包括芳族化合物，醚和炔烃。FeSEM分析显示，纳米颗粒的尺寸范围为12nm至101nm;然而，DLS分析估计纳米颗粒（108.3nm）的较大平均尺寸，因为它测量了纳米颗粒的流体动力学半径。纳米颗粒的Zeta电位为-16nm，纳米颗粒的XRD图案在38.02°，42.94°，64.45°，77.20°和81.47°处具有不同的峰，这是典型的面对立方（FCC）结构银色。纳米颗粒的绞车等效抗氧化容量（TEAC）估计为300.91 μ.M Trolox/mg银纳米颗粒。纳米颗粒抑制Kasumi-1细胞增殖。抑制Kasumi-1细胞增殖的半最小抑制浓度（IC 50）是49.5 μ.和13.25克/毫升μ.G /ml。纳米颗粒在S(增加5%)和G2/M(增加3%)阶段诱导Kasumi-1细胞周期阻滞。结论．纳米颗粒由黄芪茎皮提取物合成B. Dalzielii.通过激活细胞周期骤停来抑制Kasumi-1白血病细胞的生长;因此，它们是潜在的抗血糖剂。

1.介绍

急性髓性白血病（AML）继续成为一个严重的健康问题，因为有效的化疗来打击这种疾病仍然缺乏[1］.该疾病负责儿童中约15-20％的急性白血病，它占了一半以上的儿科白血病患者[2］.尽管当前可用化疗的治疗和管理的效率大大提高AML导致长期生存在大约65%的AML儿科患者,化疗有许多严重的副作用,包括以下几点:(a)有些患者不应对化疗治疗;(b)半数对化疗有反应的患者在化疗后会复发并最终死亡[2- - - - - -4］.因此，迫切需要发现更有效的治疗AML的新化疗方案。

Boswellia dalzielii.是一种植物，它是一些西非国家的药用目的，如加纳，贝宁，多哥，布基纳法索，北尼日利亚，喀麦隆和北象牙海岸[5，6］.该植物传统上用于治疗几种疾病和疾病，包括消化系统障碍，皮肤病，结核病，神经障碍，腹泻病，炎症，镇痛，发热热和牙龈炎[5，6］.实验结果也证实了这种植物具有抗伤害性[5］.这种植物有大量的富含电子的化合物，它们可以提供电子来还原银，合成银纳米颗粒[5］.这使得植物成为纳米粒子生产的良好候选者[5］.这种植物含有丰富的电子化合物，包括酚类、黄酮类、生物碱、苷类、三萜类、碳水化合物、皂素、没食子酸、蒽醌类、原儿茶酸等β-sitosterol提到但是几个[5，7- - - - - -9］.

近年来，纳米粒子的合成和应用由于其在医学、生物、制药、纺织等诸多领域的潜在用途，引起了世界各国研究人员的极大兴趣和关注[10.，11.］.物理、化学和生物(绿色)方法是合成纳米粒子的三种主要方法[12.］.然而，物理和化学方法的缺点，如环境污染，高成本和更长的反应时期，使绿色生物方法脱颖而出，是最优选的[13.，14.］.此外，生物学方法是绿色合成，其是环保，容易，无毒，廉价，合成纳米颗粒的更快方式[12.］.在绿色合成中，植物、微生物和动物材料是化合物(代谢物)的来源，作为还原剂将银还原为纳米粒子并稳定纳米粒子[15.］.

由植物化学物质(植物化合物)合成的银纳米颗粒已被发现具有抗菌、抗癌、抗氧化和抗糖尿病特性[15.］.例如，从植物化学物质中合成的银纳米颗粒Alterneranthera Sessilis，Dendrophthoe Falcata，Albizia Adianthifolia，Morinda Citrifolia，Detarium Microcarpum，和艾turcomanica分别对前列腺癌(PC3)、乳腺癌(MCF7)、肺癌(A549)、宫颈癌(HeLa)、胰腺癌和胃癌(AGS)细胞的生长有抗增殖作用[14.，16.- - - - - -20.］.因此，由于迫切需要对白血病有效治疗进行有效治疗，在这项研究中，我们研究了银纳米粒子合成的效力B. Dalzielii.茎皮代谢产物抑制AML细胞系Kasumi-1细胞的生长和增殖。

2.材料和方法

2.1。植物提取和银纳米粒子合成

植物的茎吠B. Dalzielii.是在尼日利亚包奇州卡塔古姆地方政府区域的阿扎尔森林收集的。该植物样本的身份由尼日利亚Ahmadu Bello大学生物科学系的合格专家鉴定。从植物样品中提取植物化学物质的方法是将50 g粉状样品浸泡在250 ml水中，并将混合物连续摇匀孵育5天。用同样的方法，用同样的粉末，再提取一次。将混合物过滤，并将含有富电子代谢物的液体馏分(水提取物)干燥。将5克植物提取物重悬于水中(250毫升)，并在室温下将液体提取物加入750毫升5毫米硝酸银(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)。反应持续1.5小时，在此过程中，银纳米粒子被合成。每30分钟用紫外可见光谱仪(AK36735, Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA)观察一次反应，测量混合物在400-700 nm波长范围内的吸光度。

2.2。纳米银的表征

使用傅里叶变换红外（FTIR）光谱（Ferkin Elmer System 2000，Waltham，Massachusetts，USA）鉴定使用傅立叶变换红外（FTIR）光谱（Ferkin Elmer System 2000）的植物提取物中化合物中的化合物的官能团。使用能量过滤扫描电子显微镜（EFSEM）（Shimadzu UV-3600，Kyoto，Japan）观察合成银纳米颗粒的形态。使用动态光散射（DLS）仪器（DLS）仪器（Zetasizer Nano Zs，Malvern Instruments，Ltd，Malvern，UK）测定银纳米粒子的多分散性指数，流体动力学尺寸和Zeta电位。使用X射线衍射仪（Bruker Axs K. 3-9，Yokohama-Shi，Kanagawa，Japan）对纳米颗粒进行X射线衍射（XRD）分析。

２.３.1,1-二苯基-2-苦基肼自由基清除试验

DPPH测定采用的是[21］.简而言之，150 μ.l 0.2 mM DPPH溶液(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)加入到50μ.L合成的银纳米颗粒或50个 μ.L的不同浓度(0,30,60,120,240,480)μ.g/ml)的Trolox抗氧化溶液(Acros Organics, Newton Dr, Carlsbad, CA, USA)在96孔板的孔中。将混合物混合，在黑暗中孵育20分钟。在517 nm处读取溶液的吸光度值。每个样品溶液(包括特洛克斯和纳米银)的自由基清除活性百分比(RSA)计算公式如下: 其中Ba是空白吸光度，SA是样品吸光度（滴水或合成的AgNP）。

绘制了拖车标准曲线，然后从标准曲线估计纳米颗粒的纳米颗粒的替索等当量抗氧化能力（TeaC）。

２.４.细胞培养、生长和维护

kasami -1细胞(leibnzi - institute DSMZ, Braunschweig, Germany)在含有10% (v/v)胎牛血清(FBS)和1%链霉菌(青霉素-链霉素)抗生素的RPMI 1640完全培养基中培养并维持。细胞在烧瓶生长表面上生长到80%汇合后进行传代培养。培养基、胎牛血清、抗生素取自赛莫Fisher Scientific公司(Waltham, Massachusetts, USA)。

2．5．PrestoBlue抗增殖试验

合成的纳米银颗粒对AML Kasumi-1细胞的抑制作用通过PrestoBlue抗增殖试验进行研究，实验程序如下[21］.将细胞（5000个细胞/孔）接种到96孔板的孔中，并用不同浓度的银纳米颗粒处理（0-70 μ.g / ml）48和72小时。治疗后，10 μ.每孔加入presstoblue resazurin染料溶液(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)，在黑暗中孵育1-2小时。然后用分光光度计分别在600 nm(发射态)和570 nm(激发态)下读取各孔的吸光度值。每一浓度的银纳米颗粒的细胞存活率百分比使用以下公式计算: 其中SF是样品(用银纳米颗粒处理过的细胞)荧光，BF是空白荧光，CF是对照(只用DMSO处理过的细胞)荧光。

2.6。流式细胞术细胞循环分析

基于试剂制造商提出的方法，使用PI / RNase细胞周期分析试剂（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Carsbad，CA，CA，USA）进行细胞循环分析。Kasumi-1细胞（2.5×10⁵ cell/well) in 3 ml were seeded in wells of 6-well plate. The cells were treated with silver nanoparticles (20 μ.g / ml）72小时。然后，收获处理的细胞，通过在4℃下孵育1-2小时，用70％乙醇用70％乙醇固定。用PBS洗涤固定细胞，将它们重新悬浮在0.5ml的PI / RNase染色溶液中。将细胞在室温下在黑暗中孵育15分钟。然后，通过流式细胞仪分析它们而不会延迟。

2.7。统计分析

采用SPSS软件(24版)进行统计分析。数值表示为3-4个独立结果的平均值±SEM。采用单因素方差分析确定结果的显著性，仅在显著水平上存在差异的结果 呈现。

3。结果与讨论

3.1。UV-vis.

通过紫外-可见光谱定期观察在含有硝酸银和植物提取物的反应混合物中纳米银的合成情况，结果如图所示1．观察到在480 nm波长附近有一个宽峰出现，且其强度随时间增加。在480 nm附近观察到的峰可能是在反应混合物中合成的纳米颗粒的表面等离子体共振(SPR)。该观察结果与其他天然合成的银纳米颗粒的SPRs相似[22，23］.例如，由辣椒(Capsicum frutescens.),Buddleja globosa在480 nm的反应混合物中观察到代谢物[23，24］.峰(SPR)的展宽表明所合成的纳米粒子是聚分散的，具有不同的形状和尺寸[25］.

３．２．纳米银的红外光谱分析

对合成的纳米银进行了红外光谱分析，揭示了植物提取物作为纳米银合成还原剂的官能团。纳米颗粒的红外光谱有几个峰，这些峰可以归因于某些化合物的许多官能团(图)2)。3371nm处的峰对应于有机化合物的羟基的O-H拉伸[26］.在2926 nm, 1445 nm, 1231 nm, 1198 nm, 1054 nm, 1030 nm, 810 nm, 757 nm处发现的峰可以归因于C-H拉伸的振动，这是芳香族和醚类化合物等不同官能团的一部分[26］.2351处的峰可以归因于炔化合物的-C≡C-三键拉伸[26］.1677 nm处的峰表明可能存在烯烃官能团- C=C-的伸长和羧酸官能团- C=O-的伸长。1612处的峰可能是芳香族化合物的- C- o -和- C=C- C的延伸。在1336 nm处发现的峰也可能归因于苯酚和叔醇中的O-H拉伸[26］.

３．３．纳米银的表征

对银纳米粒子的FESEM分析揭示了纳米粒子的形貌和尺寸(图)3.)。纳米颗粒看起来聚集，它们具有不同的形状，包括圆形，球形，杆和矩形形状（图3.)。此外，纳米颗粒的尺寸在12nm至101nm之间变化（图3.)。因此，SEM结果表明，纳米粒子的大小和形态不同，是多相的，这在植物合成的银纳米粒子中并不少见[27］.

能量色散x射线(EDX)光谱进一步证实了银纳米粒子的合成在3kev左右出现了一个光学吸收峰，这表明溶液中存在银纳米晶体，因为这个峰代表了纳米晶体的表面等离子体共振[28] （数字4)。在银纳米粒子溶液中以大量发现的其他元素包括碳，氧，铝，硫和氯（图4)。

研究了合成纳米颗粒的粒度分布，使用DLS研究，揭示颗粒高度聚尺寸分散（图5（a）)。纳米颗粒的平均粒径为108.3 nm。多视差指数估计为0.403(图5（a）)。由于银纳米粒子的团聚，用DLS估计的纳米粒子尺寸比SEM分析的结果要大[29］.此外，与SEM不同的是，DLS测量了银纳米颗粒的流体力学半径，其中包括来自植物提取物的封盖还原剂层[29］.

银纳米颗粒具有-16mV的Zeta电位值（图5（b））落入认为相对稳定的范围内（±10-20 mV）[30.］.zeta电位的负值表明粒子之间存在排斥力，这也可以增强粒子的稳定性[31］.值得支持的是，纳米粒子的zeta电位值也低于一些报道的植物化学合成的银纳米粒子的值，这些纳米粒子被认为是稳定和有效的细胞毒素[29] （数字5（b）)。

进行X射线衍射（XRD）分析以确定合成的粘土纳米颗粒的结晶结构和表征。数字6显示了银纳米粒子的XRD谱图B. Dalzielii.．结果表明，在2℃范围内，XRD谱图在38.02°、42.94°、64.45°、77.20°和81.47°有明显的峰θ.可以分别向其索引到（111），（200），（220），（311）和（222）银的晶体间（FCC）结构的晶体平面[32］.x射线衍射图谱也与粉末衍射标准联合委员会(JPDS)文件号所报告的规范相似。典型金属银04-0783 [33］.把这些放在一起，XRD图谱显示，合成的银纳米颗粒在本质上是结晶的。

3.4。合成纳米颗粒的抗氧化活性

为了评估合成纳米颗粒的生物活性和潜在的健康益处，使用DPPH测定评估其抗氧化能力，因为抗氧化剂通常有助于癌症，阿尔茨米默氏症，炎症疾病等许多疾病的管理，预防和治疗疾病[34］.纳米颗粒的抗氧化能力估计为Trolox当量抗氧化能力（茶叶）。Trolox标准曲线具有等式y= 0.1732x+ 0.645R²值为0.9918(图7)。1毫克合成的纳米粒子猝灭了53.73%的氧化剂DPPH溶液，计算其TEAC值为300.91±13.42μ.M Trolox/mg银纳米颗粒。与其他纳米粒子和药用植物的抗氧化能力相比，这个量被认为是显著的[21，35- - - - - -37］.El-Rafie和Hamed [38]报道榄仁树属catappa提取介导的银纳米颗粒具有显着的自由基清除效应和高抗氧化活性。类似地，生物酰胺纳米颗粒合成Pongamia Pinnata.被证明具有自由基猝灭活性和抗氧化潜力的植物化学物质[39］.此外，研究还表明，纳米银生物合成的化合物ProsoPis Farcta果实具有抗氧化活性[40］.因此，考虑到所有这些推论，可以说，来自代谢物的合成纳米颗粒B. Dalzielii.提取物具有抗氧化效果。

3.5。银纳米粒子对Kasumi 1细胞的抗增殖作用

采用PrestoBlue细胞活力法研究纳米颗粒对Kasumi-1白血病细胞的抗增殖作用，结果如图所示8．治疗48小时后，10 μ.G / ml纳米颗粒仅抑制细胞生长的约3％;但是，随着浓度的增加，癌细胞群减少，70 μ.G /ml纳米颗粒抑制60%的细胞生长，这是一个显著的百分比。预期，纳米颗粒在72小时后的抑制效果更高，更明显。72小时后，10小时μ.G /ml纳米颗粒对白血病细胞生长有38%的抑制作用，且随着纳米颗粒浓度的升高，细胞生长明显下降。使用的最高浓度(70μ.G /ml)抑制92%的细胞生长。抑制Kasumi-1细胞生长的半数最低抑制浓度(ic50)为49.5μ.和13.25克/毫升μ.11 / ml分别在48小时和72小时。因此，纳米颗粒在浓度和时间依赖的方式中抑制Kasumi-1白血病细胞的增殖。结果表明，纳米颗粒抑制了Kasumi-1细胞的生长，它们与其他合成纳米颗粒，物质和化学物质的抑制作用的结果相媲美[1，41- - - - - -45］.纳米银的合成辣木果冻叶提取物抑制AML Kasumi-1细胞生长，IC50为7.5 μ.G /ml [46］.此外，PLGA-antiCD44-PTL纳米颗粒通过降低Kasumi-1白血病细胞存活率40%来抑制其[47］.此外，Li等人[48报道，它们合成的CD33靶向脂质纳米颗粒（ACD333LNS）有效地将GTI-2040递送至预期靶标以抑制KASUMI-1细胞的增殖。纳米颗粒（ACD33LN / GTI-2040）的效果比已知的抗血清血症药物ARA-C更有效。因此，基于这些观察结果，合成的纳米颗粒是潜在的抗血糖癌药剂。

3.6。银纳米粒子对Kasumi 1细胞细胞周期进展的影响

通过流式细胞仪分析Kasumi-1细胞周期进程对合成纳米颗粒的响应，结果如图所示9．大多数控制细胞（未处理）在G1相（85％）处，而其余的分别在S（11％）和G2 / m（4％）相。在G1处发现大多数未处理的细胞（对照）表明细胞是受到主动活性的，增殖和健康的指示[49］.相反，当用合成的纳米颗粒处理它们时，细胞周期相中细胞的分布被破坏，该合成纳米颗粒被导致在S和G2 / M相的细胞的显着积累和停留，随后在G1相时细胞减少．G1相的细胞的百分比降至76％，S和G2 / m阶段的百分比分别增加至16％和7％。观察到的S期被捕结果表明，细胞DNA的合成和复制存在损伤，因此导致随后的G2 / M期被停留，以防止这种缺陷细胞进入有丝分裂并在细胞周期过程中进行[50］.这将导致细胞的增殖被延迟，也可能导致细胞死亡[51］.在类似的研究中，Khor等人。[46还发现从中合成的银纳米颗粒m .鉴定叶提取物在Kasumi-1细胞中诱导S期细胞周期停滞。

4.结论

本研究研究了由黄芪茎皮提取物富电子代谢物合成的银纳米颗粒的抗白血病作用B. Dalzielii.工厂。有趣的是，合成的银纳米颗粒被发现具有相当大的抗氧化能力。更重要的是，纳米颗粒以浓度和时间依赖性的方式抑制Kasumi-1白血病细胞的生长。然后，纳米颗粒诱导Kasumi-1细胞周期阻滞在S期和G2/M期。因此，合成的银纳米颗粒是潜在的抗白血病药物。然而,体内需要研究确定纳米颗粒的毒性和抗白血病作用在动物实验对象。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

利益冲突

作者对本文的发表没有利益冲突。

致谢

本研究部分由高校马来西亚大学先进的医疗和牙科学院资助。

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