使用RNAI技术干扰Zfx基因增加马鹿的雄性比率(Cervus elaphus)的后代

摘要

锌指蛋白x链(Zfx）被认为是性别决定因素，并在精子发生中发挥着关键作用。RNAi是一种有效的沉默方法ZfxmRNA表达。然而，对RNAI技术的使用几乎没有研究以控制红鹿后代的性行为（Cervus elaphus）.本研究的目的是首次探索一种通过沉默基因来改变马鹿后代性别比例的有效方法Zfx在精子发生期间。三种重组表达载体PLL3.7 / A，PLL3.7 / B和PLL3.7 / C被构造成中断Zfx基因。结果表明表达了ZfxpLL3.7/A显著沉默mRNA ( ），与对照组相比。注射pLL3.7/A的那组产生了94只马鹿，其中包括68只雄鹿和26只雌鹿。雄性率（72.34％）明显高于对照组（ ）.我们的结果表明ZfxsiRNA是控制马鹿后代性别的有效方法。本研究进一步证实Zfx基因在X精子发生过程中起重要作用。

背景

马鹿(Cervus elaphus)是我国二级保护动物，是重要的经济动物。鹿角产量高，经济价值大。鹿茸是一种珍贵的中药，是一种珍贵的滋补保健产品[1，2］．鹿茸被认为具有多种药理活性，如免疫调节、伤口愈合、抗炎和增强性功能[2- - - - - -4］．饲养马鹿的主要目的是为了获得鹿角，而只有雄鹿才会生产鹿角，因此，为了获得更多的雄鹿以获得马鹿养殖的经济效益，生产者有着极大的兴趣。因此，未来迫切需要一种技术来控制马鹿的性别，提高雄比，是增加鹿角产量，增加经济效益的重要手段。

二倍体脊椎动物的后代性别取决于男性父母的性染色体[5］．x和y单倍体精子之间的斗争不仅存在于卵巢中，还存在于睾丸中[6］．性别测定中的大多数努力将根据物理参数分析X和Y精子，例如密度，游泳速度，表面电荷和性别特异性抗原。到目前为止，流式细胞术（FCM）分析是精子分离的最准确的方法，其中可以达到高达90％的准确度[7］．虽然可以实现使用分类精子的成功，但它是非常昂贵的，并且超出大多数生产设施的专业知识。我们假设控制X和Y精子的关键特异性mRNA可能是以低成本确定动物性别的有效方法。

Zfx和Zfy被认为在精子发生期间在性别测定中发挥重要作用[8- - - - - -11.］．锌指蛋白质基序与核酸结合蛋白的结合在早期胚胎的性别测定中起重要作用[12.，13.］．比较Zfx/Zfy基因是一种简单而准确的动物性别识别方法，目前已被广泛使用[14.- - - - - -16.］．全长Zfx蛋白编码在X染色体上，包含一个核定位序列(NLS)、一个酸性转录激活结构域(AD)和一个dna结合结构域(DBD)，该结构域由13个c2h2型锌指组成[17.］．Zfx与X精子发生有关，可作为强转录激活因子，通过核膜引导靶基因在X精子核中的定位[18.］．Zhang和他的同事[19]发现Zfx在X精子发育过程中起着重要作用。沉默的表情Zfx可以干扰Meiosis后的这些性别特异性基因的正常功能[19.］．

RNAi是基因沉默的有效方法，可以有效地使靶基因失去职能[20.- - - - - -22.］．使用RNAi沉默表达Zfx限制或恶化单倍体X精子的发育是使后代性别比例向男性倾斜的有效途径[19.］．然而，利用RNAi技术来控制马鹿后代性别的研究还很少。因此，在本研究中，首先旨在干扰X精子的发展，以改变红鹿后代的雄性比例，提高世界上红鹿产业的市场经济效益的特定的RNA干扰片段。

2。材料和方法

２.１.实验动物

健康马鹿选育自新疆生产建设兵团第二师34只，其中牡马16只，干马216只。其中随机选取8只雄鹿和108只雄鹿作为实验组，其余为对照组。所有实验动物均在相同条件下饲养。本实验使用的所有程序均经石河子大学动物保护与使用委员会审核通过。所有马鹿的饲养和使用都严格按照石河子大学动物研究委员会的指导方针进行。所有切除睾丸手术均在麻醉下进行，每只鹿4 mL盐酸氧拉嗪注射液(100 mg/mL)(青岛汉和动植物医药有限公司，产品编号171225)，复苏用尼可撒米注射液(250 mg/mL) 8 mL(青岛汉和动植物医药有限公司，产品编号171225)。产品编号171106)，每只鹿按照制造商的说明，并尽一切努力减少痛苦。本研究未对动物造成任何健康影响。注射后，动物被送回它们的标准住房。

２.２.PLL3.7-shZfx重组载体的构建

Zfx通过红鹿评估并选择siRNA序列Zfx序列（KP257294.1）和siRNA设计原则[23.，24.］．根据siRNA的设计原理，加工了设计的siRNA序列的初步筛选，然后选择了SiRNA序列并将同源性与红鹿进行了比较Zfysequence (MN560153) through BLAST。剔除非特异性片段，最终筛选出3个特异性siRNA序列(表)1）.限制性内切核酸酶（高致病性禽流感和XHOI.）加入5和3.siRNA序列的末端。每个寡核苷酸序列的意义和反义链(表2退火。将退火后的产物与经剪切的pentilox 3.7 (pLL3.7)连接高致病性禽流感和XHOI.（Takara，Biotechnology Co.，大连，中国）。慢病毒转移载体pletilox3.7（pll3.7）含有小鼠U6 RNA pol III启动子[1］．此外，高致病性禽流感和XHOI.在载体上发现限制酶，细菌抗性氨苄青霉素和可选标记GFP，这对于转化的或转染的阳性细胞的电阻筛选方便。重组siRNA表达载体被命名为PLL3.7 / A，PLL3.7 / B和PLL3.7 / C，然后转化为大肠杆菌DH5α活跃细胞（天根生物科技有限公司，中国北京）。使用天化迷你质粒试剂盒（天根生物科技有限公司，北京，中国）从细菌溶液中提取质粒并储存在-20°C。

3.Zfx体外基因RNAi实验

3.1。生殖细胞的分离与培养

改进的两步酶消化方法用于分离红鹿睾丸的生殖细胞[25.］．将精子源细胞在CO中的体外与Sertoli细胞一起获得₂孵化器(26.，27.］．将细胞在6孔细胞培养板中培养，并且每个含孔 - 培养箱中的生物细胞在37℃温度下，5％CO₂， 95%的相对湿度。

３．２．转染的ZfxRNAi载体和QRT-PCR分析

在培养24小时后，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，USA）将重建的载体转染到培养的细胞中。改变营养溶液，在培养期间每24小时在Lipofectamine 3000下观察细胞。在该实验中，通过分别在转染24小时后，通过荧光倒置显微镜观察荧光蛋白的表达分别观察24小时，48小时，58小时和72小时。通过天根总RNA提取试剂提取细胞RNA的最高转染效率，然后通过RT试剂盒（Takara）反转转录到cDNA中。

3.3。每种载体的RNAi效率在体外

mRNA水平Zfx和GAPDH.（桌子3.)采用RT-qPCR (LightCycler2.0, Roche, Basel, Switzerland)检测。RT-qPCR反应体系包含10μL SYBR@ Premix Ex TAqTM (2×)， 0.4μl寡核苷酸引物，2 μL模板，无菌蒸馏水高达20 μL.程序如下:初始变性步骤(95°C 30 s)， 95°C 10 s, 60°C 30 s, 72°C 30 s共40个循环。每个样本重复三次以提高准确度。

4。Zfx基因RNAI实验在体内

4.1。红鹿睾丸中的质粒注射

睾丸注射技术是动物基因工程和胚胎工程的重要技术手段。睾丸注射包括三种方法：Rete睾丸注射，嗜聚小管注射和睾丸间质注射，其中Rete睾丸注射可以有效地获得携带靶基因的阳性后代[28.］．我们实验室成功使用睾丸注射结合RNAi干扰技术显著改变后代性别[19.，29.- - - - - -31.］．在本研究中，马鹿全身麻醉后，采用注射器经纵轴注射至睾丸网。实验组用含青霉素-链霉素的PBS稀释重组质粒表达载体，按每头公鹿3mg(每头公鹿1.5 mg)注射至8只雄鹿的睾丸，10天注射4次。第4次注射后3天，将8只雄鹿随机放入8个雌性繁殖圈(每个繁殖圈9 ~ 15只)进行自然交配。对照组为未注射RNAi载体的正常雄鹿。在整个实验过程中，所有条件都是相同的。

4.2。统计分析

数据采用SPSS Statistics 20.0 (IBM Corp.)进行分析。定量结果用GAPDH.表达式为内标和双标曲线。用公式计算mrna表达的差异 ，在哪里 （GAPDH.), （控制）。通过单向ANOVA（LSD）量化mRNA水平差异的显着差异。利用该评估后代的男性和女性比例差异的意义测试。图是由GraphPad Prism 8.0.1构建的。

5.结果与讨论

5.1。结果

5.1.1。生殖细胞分离和转染

用胶原酶IV、透明质酸酶和胰蛋白酶将马鹿睾丸组织消化成生殖细胞和支持细胞;分离的生殖细胞圆形饱满，轮廓清晰，大小均匀。然而，分离的支持细胞是不规则的;它们大多数是多边形和三角形(图1）.培养24 h后，将重组载体转染到培养细胞中。转染24 h后无荧光表达;但在48 h有一定的荧光表达，在58 h荧光表达量最高;转染效率可达90%左右。72h后，细胞活力下降，部分细胞出现凋亡。转染58 h后，提取细胞mRNA，逆转录为cDNA。转染58 h的结果表明Zfx基因RNAi载体成功转入马鹿生殖细胞(图)2）.

6.的表达Zfx通过QRT-PCR注射组和对照组mRNA

的ZfxmRNA水平结果显示，所有重组载体均低于空白组和无载体组的对照组(图3.）.具体来说,Zfx注射PLL3.7 / A的测试组mRNA水平（ ），显著低于对照组，且转染pLL3.7/B较对照组减少( ）.因此，选择PLL3.7 /载体用于体内实验中使用，因为它具有最不表达的Zfx信使rna ( ）.

7.统计分析后代性别比例

马鹿的妊娠期是 天，每个胎儿有1个垃圾。作为对照组的非反应组生产98个红鹿，包括50名男性和48名女性，而群体注射了PLL3.7 / A产生的94个红鹿，包括68名男性和26名女性。雄性率（72.34％）明显高于对照组（ ）（桌子4）.

这一结果表明Zfx基因在X精子形成过程中起着重要作用。ZfxsiRNA是控制红鹿X精子发生和后代性别比的先进方法。

受胎率是指。怀孕/不。所有的女性;繁殖率是指每次妊娠的产仔数;死胎率意味着。死产的胎儿/不。的妊娠。表示非注射组与治疗组差异极显著( ）.

8.讨论

虽然性别决定机制的生殖需要多个基因相互作用，但自然界的性别比例稳定在1:1 [32.］．精子发生过程中X或Y精子的形成对后代的性别决定起着重要作用[33.］．我们实验室之前的研究发现Zfx和ZfysiRNA可以改变动物后代的性别比例，如牛、鼠和羊[19.，30.，31.］．马鹿是一种特殊的经济动物，其鹿角具有巨大的市场经济价值。然而，利用RNAi技术来控制马鹿后代性别的研究还很少。在我们的研究中，马鹿Zfx最初设计siRNA是为了改变后代的性别比例，这再次证明了siRNA的重要作用Zfx在性别。更重要的是，提高马鹿后代雄比，对提高鹿茸产量和经济效益具有重要意义。

目前，关于这方面的研究还很少Zfx基因沉默，使后代的性别转移，因此行动的机制Zfx精子不清楚。一些研究表明，减少了水平Zfx/ZfymRNA表达将使X / Y精子的生理功能更差，这可能影响后代性别[19.，29.- - - - - -31.，34.］．Zfy控制精子头尾形成及颈部发育[35.]，这在减数分裂I和梅索病二世之间是高度表达的。它可以调节精子形态和罗西效率，并促进第二次减少病程[36.，37.］．相似地，Zfx基因在减数分裂I后是女性特异性的，并且总是在精子发生过程中表达[18.］．高表达Zfx在成年小鼠睾丸的圆形精细胞中，睾丸控制精母细胞的自我更新。一般来说,Zfy基因是保证第二次减数分裂发生的基因，与x相关Zfx在染色体上具有促进效果[38.］．降低的表达水平ZfxmRNA会影响单倍体X精子的发育，从而导致雌性后代的减少[19.］．

但与对照组相比，实验动物组没有出现健康异常，繁殖性能下降。然后在第四次注射病媒生物后10-40天内，将公马鹿置于雌马场自然交配。这与绵羊的生精周期和生精波是一致的[39.]其中Zfx与马鹿的同源性最接近。根据我们实验室经验，四次注射干扰碎片一般会产生45天的效果，超过45天就没有效果了，注射后10-30天是最佳匹配时间。实验组母鹿的生育率、难产率、流产率、繁殖率、空胚率、后代存活率、后代畸形率与对照组比较均无异常。综上所述，在相同饲养条件下，与正常对照组相比，试验组子代的性别比有显著变化，雄性比达到72.34%。说明注射干扰片段改变了后代的性别比例，但不影响动物的生理功能和繁殖性能。然而，随着公鹿数量的增加，这似乎也可能会造成一些长期的生产问题;例如，雌性鹿的减少也会导致后代的减少。但是我们农场的母鹿数量足够多，不会因为注射而影响后代。另外，一般来说，鹿场每年都会筛选和保留足够数量的繁殖能力强的母鹿，不会因为性别控制而减少后代数量。因此，沉默的Zfx对于未来的性别控制，是安全有效的。

精子发生是一种高度监管和有序的过程。它受到许多基因的调节，但其机制尚不清楚[40，41.]需要进一步研究。但是，这项研究，Zfx基因沉默技术的成功应用，显著增加了后代雄性马鹿的数量，不仅提高了生产的经济效益，也为后续科研中性别控制机制的研究提供了理论参考。

9.结论

本研究的结果表明，使用RNAi来打断Zfx是一种有效的控制马鹿性别的方法，并进一步证实Zfx基因在X精子发生过程中起重要作用。

数据可用性

马鹿Zfx序列和马鹿Zfy序列分别在加入号KP257294.1和MN560153下归档NCBI Genbank。

信息披露

资助机构没有参与研究的设计，也没有参与数据的收集、分析和解释。

的利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

Limin Wei和Song Jiang在这项工作中同样贡献。

致谢

石河子大学生产建设兵团新疆省高层次人才科研启动基金项目(RCZK2018C13)资助我们要感谢Bismark Kyei先生的英文编辑。

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