文摘
背景。长非编码rna (lncRNAs)在许多生物过程中发挥了至关重要的作用。lncRNA HAGLROS证明在各种癌症促进细胞增殖和迁移。然而,HAGLROS在骨肉瘤的功能和分子机制仍是阐明。方法。存在分析被用来检测HAGLROS在骨肉瘤组织样本的相对表达和细胞。CCK-8和Transwell化验进行评估的影响HAGLROS OS细胞增殖和入侵。荧光素酶报告实验验证ROCK1之间的交互和mir - 152。结果。在我们的研究中,我们发现HAGLROS增加骨肉瘤样和细胞系的表达与正常组织和细胞。HAGLROS击倒抑制U2OS和SW1353细胞体外的某些功能。此外,HAGLROS消耗体内抑制肿瘤的生长和转移。机械,我们发现HAGLROS擦掉mir - 152促进ROCK1 U2OS和SW1353细胞表达。结论。总之,我们的研究表明,HAGLROS可以促进骨肉瘤发展骗取mir - 152促进ROCK1表达式。结果显示HAGLROS mir - 152 / ROCK1轴可能作为小说骨肉瘤的治疗策略。
1。背景
骨肉瘤(OS)是一种罕见的恶性肿瘤发病率低,频繁出现在青少年和老年人,高转移,预后不良(1]。除了遗传因素外,骨肉瘤的原因主要包括某些化学药剂,高剂量的辐射,和某些病毒(2]。在过去的几十年中,相当大的在骨肉瘤的治疗已经取得了进展,包括开发化学药物和手术技术的改进,大大提高了患者的生存时间和生活质量操作系统。然而,仍然有缺乏理解与骨肉瘤的致病机制。
DNA的遗传信息转录、翻译和修改成蛋白质,参与调节细胞的一系列生理代谢活动。有趣的是,超过95%的人类基因组不能翻译成蛋白质。最近的研究显示,这些长非编码rna在生理活动的规定有一个重要的角色在人类癌症。长非编码RNA (lncRNA)是由超过200个核苷酸(3]。lncRNAs参与各种形式的监管程序,包括绑定到DNA、蛋白质和RNA分子或结合上述物质调节遗传信息的转录和翻译4]。lncRNAs可以用作microrna的识别和监管元素和元素与microrna的监管网络影响microrna的活动(5]。例如,在斑马鱼模型之间的交互7 sl lncRNA和mir - 125 b检测。mir - 125 b可能下调7 sl RNA lncRNA斑马鱼的表达,从而影响监管7 sl lncRNA对细胞生理活动的影响(6]。HAGLROS增加在多种肿瘤细胞和充当致癌基因,这可能促进肿瘤发展通过调节mir - 100 / ATG5轴和PI3K / AKT / mTOR信号(7]。
在这项研究中,我们发现OS细胞的增殖抑制HAGLROS击倒后。OS细胞的转移也是HAGLROS击倒后减少。此外,发现lncRNA HAGLROS与mir - 152可能影响ROCK1下游基因的表达。
2。材料和方法
2.1。病人和组织样本
10双操作系统组织和匹配正常骨骼组织收集从操作系统手术治疗患者从闵行医院,复旦大学,从2014年1月至2017年5月。所有组织都存储在液态氮,用于提取的RNA。从所有患者知情同意了。这个项目是研究所研究伦理委员会批准在闵行医院,复旦大学(上海,中国)。
2.2。细胞系
1.19 mg - 63, hFOB, SW1353, U2OS写明ATCC和培养获得rpmi - 1640 (BI、以色列)包含10%的边后卫(BI、以色列)有限公司为5%2在37°C。
2.3。小干扰RNA合成和转染
小干扰rna (siRNAs)专门针对HAGLROS从GenePharma购买公司(上海,中国)。小干扰rna序列的5 - - - - - -CCUAUUUACUGGCAGGAGUTT-3HAGLROS;5 - - - - - -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3数控。转染进行使用Lipofectamine 2000(生命技术)根据制造商的指示。
2.4。细胞计数Kit-8扩散试验
为了检测细胞增殖能力,约2000 SW1353或U2OS细胞与不同的治疗被播种到96孔板。一段时间后,10μL CCK-8 (Dojindo化学实验室、熊本、日本)添加到每个好然后孵化37°C 2小时,和光学密度(OD)在450海里发现了使用mb - 580机(希尔,深圳,中国)8]。
2.5。Transwell化验
短暂,SW1353 U2OS细胞饥饿12小时rpmi - 1640中没有的边后卫。细胞 细胞/好添加到参议院的Transwell(用于入侵检测)或没有移民(化验)稀释基底膜基质治疗(美国加利福尼亚州圣何塞BD生物科学,)然后在室底部添加完整的媒介。孵化2天后,迁移细胞治疗与甲醇和沾染了10μg / mL DAPI (Solarbio,北京)。迁移或入侵细胞数使用倒置荧光显微镜。
2.6。Dual-Luciferase记者分析
pMIR-REPORT-HAGLROS-WT /狗和pMIR-REPORT-ROCK1-3UTR-WT /狗(Sangon生物科技、上海、中国)。此外,Dual-Luciferase记者分析系统(美国WI E1910, Promega)是用于检测荧光素酶活动的记者根据制造商的协议(9]。
2.7。存在分析
我们提取的RNA通过使用试剂盒试剂,所描述的制造商的协议(Sangon生物科技、上海、中国)。互补脱氧核糖核酸合成与Primer-Script™一步法rt - pcr试剂盒(豆类,大津,志贺,日本)。PCR扩增进行应用生物系统公司7900 ht(生物系统,促进城市、钙、美国)。lncRNA的相对量化值是由2- - - - - -ΔΔCt方法GAPDH作为内部参考。
2.8。统计分析
进行了统计分析与GraphPad Prism 6.0软件(La Jolla、钙、美国)。分析基因表达之间的关系和肿瘤的临床特点,卡方检验, - - - - - -测试、确切概率法或Mann-Whitney - - - - - -测试使用。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。HAGLROS调节系统样本
lncRNA HAGLROS调节在操作系统。调查HAGLROS表达水平在人类操作系统,rt - pcr检测进行10操作系统和正常样本。作为显示在图1,我们发现HAGLROS的RNA水平明显增加了操作系统,与正常相比样品(图1(一))( )。此外,通过使用中存在分析,我们发现,HAGLROS调节mg - 63年,SW1353, U2OS细胞相比hFOB 1.19细胞(图1 (b))( )。为了进一步证实了这些结果,我们分析了HAGLROS TCGA表达和发现HAGLROS调节系统样本与正常组织相比(图1 (c))。我们的研究结果表明,HAGLROS可能导致操作系统的发展。
(一)
(b)
(c)
3.2。击倒的HAGLROS抑制OS细胞增殖
为了进一步探索HAGLROS分子角色的操作系统,我们在操作系统进行了功能验证。我们观察到SW1353 HAGLROS表达减少和U2OS细胞治疗si-HAGLROS打倒HAGLROS(数据设计2(一个)和2 (b))( )。CCK-8增殖率的分析表明,HAGLROS击倒组与阴性对照组相比显著降低SW1353和U2OS细胞(数字2 (c)和2 (d))( )。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。击倒HAGLROS抑制OS细胞迁移和入侵
为了进一步调查的影响HAGLROS SW1353和U2OS细胞的转移能力,Transwell试验显示迁移和入侵能力都显著抑制后击倒HAGLROS SW1353和U2OS细胞相比,负控制(数字3(一个)和3 (b))( )。
(一)
(b)
3.4。HAGLROS海绵作为促进ROCK1 mir - 152
接下来,我们探讨这个lncRNA OS的位置来了解其分子机制。提出了图4,我们观察到HAGLROS主要是局部细胞质(图4(一)),这表明HAGLROS可能在细胞质中发挥其功能作为一个microrna的海绵。在硅片分析表明HAGLROS可能与上调ROCK1 mir - 152。进一步验证了mir - 152 mg - 63表达下调,SW1353 U2OS细胞相比hFOB 1.19细胞(图4 (b))( )。siRNA-mediated HAGLROS击倒了mir - 152诱导SW1353和U2OS细胞(图4 (c))( )。转染效率过度或击倒后mir - 152所示的数据4 (d)和4 (e)。此外,我们构造HAGLROS荧光素酶向量与野生型或突变mir - 152结合位点来验证直接绑定HAGLROS和mir - 152之间。正如预期的那样,结果显示HEK 293 t细胞转染mir - 152和野生型,但不是突变HAGLROS结构,荧光素酶活性明显降低(图4 (f))( )。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
此外,我们旨在验证的影响HAGLROS / ROCK1 mir - 152轴。有趣的是,ROCK1调节在OS细胞株(图5(一个))( )。Dual-luciferase记者分析显示HEK 293 t细胞转染mir - 152和野生型ROCK1显著降低荧光素酶活性,但不是突变ROCK1(图5 (b))( )。从救援化验,mir - 152抑制剂对抗HAGLROS ROCK1上差别knockdown-mediated对这些基因的表达在SW1353和U2OS细胞(数字5 (c)和5 (d))( )。上述实验结果可以确认HAGLROS海绵作为促进ROCK1 mir - 152。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
测序技术的快速发展和增加科学投资,越来越多的lncRNAs被发现和研究。不断发现lncRNA网站扩展一个巨大的空间生命科学研究,也扩大了科学和医学研究。研究发现,lncRNAs参与组织,转录和转录后的调控染色质在细胞10,11),更新我们对传统的规定的理解真核生物的基因组,让我们意识到真核生物的生命过程的复杂性。lncRNA与深入研究,有趣的是,这两个角色在癌症的发展已经越来越多地发现和理解。从功能的角度来看,越来越多的lncRNAs发现了肿瘤抑制或protooncogenes在分子水平上(12,13),大大丰富了我们对癌症发生的复杂性的理解。癌症的发生和发展的结果是一系列的细胞调节机制不能有效发挥正常作用,而lncRNA深入参与这些过程。在某种程度上,癌症细胞的干细胞特性类似于成体干细胞。例如,lncRNA ANRIL可以与polycomb压制性复合物1 (PRC1)和polycomb压制性配合物2 (PRC2)抑制INK4b-ARF-INK4a的表达,抵抗衰老机制,增强肿瘤细胞的干细胞特性(14]。肿瘤生长过程中,癌细胞的抑制机制,间隙,继续增殖和生长和组织之间打破壁垒。多个lncRNAs被发现异常表达在肿瘤和正常组织。例如,过度lncRNA段H19发现促进胃癌的发展和转移的肿瘤细胞(15]。结直肠癌的高表达HAGLROS逆相关CRC患者的生存时间。Downregulation CRC HAGLROS可能诱导细胞凋亡的细胞和抑制自噬通过调节mir - 100 / ATG5轴(16]。同样,高表达的lncRNA PVT1在非小细胞肺癌可以促进非小细胞肺癌的进展(17]。在这里,结果显示lncRNA HAGLROS可以促进OS细胞的增殖(SW1353和U2OS)和提高操作系统的入侵和迁移细胞。
有大量的非编码rna在人类细胞。这些rna可以丰富的细胞中,因为没有错误的转录,但他们的细胞代谢的重要监管角色。其中,一些单链内源性rna在19和25个核苷酸长度称为小分子核糖核酸(microrna) [18]。这些单链microrna目标mrna负调控这些基因的表达(19]。随着研究的深入,microrna的角色在细胞增殖、分化、转移、凋亡等代谢活动已经透露更多。当然,越来越多的研究暗示的功能重要性microrna在癌症。例如,miR-15和miR-16早些时候被发现负调节b细胞淋巴瘤2 (BCL2)转录后的水平,和他们的表达是负相关BCL2在慢性淋巴细胞白血病(CLL)。这些小分子核糖核酸可以诱导的抑制BCL2慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡,从而发挥肿瘤抑制基因的作用[20.]。相反,microrna还可以促进肿瘤的发展和进步。miR-21表达式是调节人类胶质母细胞瘤的肿瘤和其他癌症样本以及建立细胞系与正常组织相比,(21,22]。Downregulation miR-21表达导致肿瘤细胞凋亡增加,表明miR-21可能影响肿瘤的逐步发展和转换成恶性肿瘤通过阻断凋亡相关基因的表达(23]。尽管这项研究参与mir - 152系的子宫内膜癌细胞可能会干扰细胞过程,影响细胞周期阻滞和体外抑制肿瘤细胞的生长24]。
lncRNA在细胞的调控机制也影响microrna的监管效果,和两者之间的拮抗或协同效应共同影响下游基因的表达(5]。lncRNA HAGLROS海绵mir - 152在肺癌细胞株体外的实验,从而减少抗癌的监管能力,促进肺癌细胞的扩散和转移25]。这些报告是与我们的研究结果一致。在这项研究中,lncRNA HAGLROS擦掉ROCK1 mir - 152减少其下游基因表达,导致细胞增殖的能力的增加和能力。
miR-148/152家庭与代谢活动的监管和细胞生长。mir - 148的表达式和mir - 152往往coexpressed癌细胞(26]。mir - 152在人类恶性胶质瘤干细胞作为一个肿瘤抑制(27]。ROCK1蛋白质ρ相对卷曲螺旋蛋白激酶,同分异构体和调节细胞骨架重组的细胞粘附等作用,并据报道,ROCK1函数来调节细胞运动和细胞迁移28]。据报道,mir - 148可以直接目标ROCK1,从而抑制ROCK1转录和翻译水平,抑制肿瘤细胞的浸润和转移29日]。我们的研究结果表明,mir - 152也可以抑制ROCK1表达,从而抑制OS细胞的扩散和转移。
5。结论
总之,结果表明,沉默lncRNA HAGLROS由si-lncRNA HAGLROS显著抑制OS细胞的扩散和转移。机械的研究表明lncRNA HAGLROS海绵mir - 152,从而抑制下游ROCK1基因的抑制和促进增殖,OS细胞的入侵和转移。我们的研究为操作系统提供了新的潜在生物标志物。
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
伦理批准
实验协议成立,根据赫尔辛基宣言的伦理准则,并通过研究所研究伦理委员会在闵行医院,复旦大学。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
开封周和徐俊从方法论的发展;样本收集是由徐俊;分析和解释数据是由Xiaofan阴;和写作,评论,和/或修改的手稿是由Jiangni夏和Xiaofan阴。开封周和徐俊的贡献同样这项工作。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金(批准号81772433)在闵行区和自然科学研究项目(批准号2019 mhz086)。