网膜素-1可改善游离脂肪酸诱导的HUVECs增殖、迁移和炎症状态损伤

摘要

目标．内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发展过程中的关键病理变化。在这里，我们探讨了Omentin-1对游离脂肪酸 - （FFA-）诱导的内皮细胞损伤的影响。方法．建立ffa诱导的内皮细胞损伤模型，探讨网膜素-1在这一过程中的作用。使用细胞计数试剂盒和流式细胞仪分析细胞增殖。用划痕法和transwell法评估细胞迁移。采用免疫印迹法、反转录定量聚合酶链反应法和细胞荧光法检测内皮细胞损伤后分泌的因子。结果．Omentin-1可挽救ffa诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖和迁移能力受损。它能减少HUVECs损伤后THP-1细胞的数量，并抑制ffa诱导的HUVECs的促炎状态。结论．Omentin-1可以部分改善FFA诱导的内皮细胞损伤。

1.介绍

血管内皮是循环系统的连续单细胞衬里，其在血液和血管壁之间形成界面。该层具有多种功能，包括维持血栓性平衡和炎症反应的调节[1］．诸如血脂过血症和高血糖的一些病理条件可诱导内皮细胞损伤，其特征在于细胞凋亡增加，细胞增殖降低，以及促炎信号传导途径的激活[2那3.］．这种损伤破坏了血管内皮的稳态，引起炎症反应，从而促进了冠心病(CHD)的早期发展[4.］．

冠状动脉周围环绕着外膜脂肪组织（吃），特殊的内脏脂肪组织，没有筋膜分离。吃的体积与CHD呈正相关，与血压无关，低密度脂蛋白胆固醇，高密度脂蛋白胆固醇以及其他一些传统风险因素[5.］．脂肪组织，包括EAT，在脂解过程中分泌大量的非酯化脂肪酸[6.那7.］．这些游离脂肪酸(FFAs)激活toll样受体(TLR)-4，最终导致核因子κ B (NF-)的增加κ..B)活动。这改变了内皮细胞的形态，使其进入炎症状态[8.］．FFAs还能下调血管内皮生长因子(VEGF)的合成，抑制内皮损伤的修复[9.］．此外，游离脂肪酸的过度分泌会损害心脏结构[10］．游离脂肪酸也可能导致冠心病的发生和发展。

网膜素-1是一种新型的脂肪细胞因子，表达于EAT、网膜脂肪组织和其他内脏脂肪组织中[11］．它能抑制肿瘤坏死因子α.(肿瘤坏死因子-α.)诱导的内皮细胞炎症状态[12]，下调血管平滑肌细胞的细胞外基质合成[13]，并在骨蛋白缺乏小鼠中衰减动脉钙化[14］．尽管有这些血管保护作用，但已知omentin-1可以预测冠状动脉侧枝循环[15］．此外，Opentin-1的血浆水平与老年患者的CHD和心力衰竭有关[16］．提示网膜素-1可能具有抗动脉粥样硬化的作用。然而，网膜素-1在ffa诱导的内皮细胞损伤中的作用尚不清楚。本实验建立ffa诱导的内皮细胞损伤模型，探讨网膜素-1对内皮细胞损伤过程的影响。

2。材料和方法

2．1．细胞培养与处理

Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were obtained from Procell (CL-0122) and cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, HyClone) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin (P/S). Cells from passages 3 to 8 were used for experiments. Palmitic acid (PA; P5585, Sigma), a representative FFA in vivo, was prepared in dimethyl sulfoxide (DMSO). Confluent HUVECs were serum-starved for overnight in non-FBS DMEM, and then the medium was replaced with FBS-containing DMEM. HUVECs were incubated with PA and/or recombinant human omentin-1 (9137-IN-050, R&D) as follows: control (0 mM PA in phosphate-buffered saline [PBS]), DMSO (0 mM PA in DMSO), 1 mM PA, 1 mM PA + 100 ng/mL omentin-1, 1 mM PA + 150 ng/mL omentin-1, or 1 mM PA + 200 ng/mL omentin-1 for 24 h.

THP-1细胞购自Procell (CL-0233)，在Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (HyClone)培养基中培养，培养基中添加15%胎牛血清和1% P/S。3 - 5代细胞用于实验。

2．2．细胞增殖实验

血清饥饿细胞(1 × 10^3.）将其接种到96孔板中，并用Pa和/或重组人类全膜素-1（如上所述的浓度）处理24小时。根据制造商的建议，使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）（CCK-8）（40203ES76，YEASEN）测定测量细胞增殖。

2．3．细胞周期分析

使用细胞周期分析试剂盒（FXP021,4A Biotech）用于分析在用PA和/或重组人类难题-1的Huvecs治疗Huvecs后的细胞周期相的变化-1。处理后收集细胞，用PBS洗涤三次，并在4℃下固定在95％乙醇中过夜。细胞（1×10^6.用碘化丙啶（PI）染色并使用流式细胞术检查。使用FlowJo 7.6.1软件分析数据。

2.4。划痕测定

HUVECs以2 × 10的密度接种到6孔板中^5.细胞/well和血清饥饿24 h。每孔表面的细胞层用10-轻轻划伤μ.l移液器尖端。用PBS冲洗孔以除去任何细胞碎片，并填充含有2％FBS的培养基，具有PA和/或重组人类全膜素-1（如上所述的浓度）。使用显微镜在0,12和24小时获得图像。使用Image Pro加上6.0软件分析并计算伤口闭合速率（（24小时初始伤口区域伤口区域/初始伤口区域）。

2.5。迁移试验

利用24孔改良Boyden室研究HUVECs迁移(8μ.m，康宁）。在用PA和/或重组人类全膜素-1（如上所述的浓度）处理后24小时，收集Huvecs并重新悬浮在无血清DMEM中。大约5×10^4.细胞在200年μ.在上腔室中播种L含血清DMEM，而下腔室填充600 μ.l DMEM含有10％的FBS。孵育24小时后，擦拭膜的上表面上的细胞，而迁移到膜的下表面的细胞用4％多聚甲醛固定20分钟并用晶体紫溶液（CO 121，Beyotime）染色5 min. Images were obtained using a microscope (Leica DM5000 B). The number of migrated HUVECs was counted in three random fields (200× magnification).

2.6。Western Blotting分析

处理24 h后，HUVECs使用含有1%苯基甲基磺酰氟(PMSF G2008, Servicebio)的放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液(WB3100, NCM Biotech)裂解。细胞裂解液经超声处理进一步解离，12000离心× g at 4°C for 30 min to obtain supernatant. Protein concentration in the supernatant was determined with the bicinchoninic acid (BCA) assay (23227, ThermoFisher Scientific). Proteins (20 μ.g)在10% Bis-Tris凝胶上分离，分离的条带转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore IPVH00010)。膜在25°C的5%脱脂牛奶中封闭2 h，并在4°C下与针对以下蛋白质的一抗孵育过夜:微管蛋白(1:40 0稀释;ab6046 Abcam);甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(1:40 000稀释;T0004、亲和);细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)(1: 800稀释;4915年代,CST);单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)(1: 1000稀释;DF7577、亲和);NF -κ..B(1: 1000稀释;# 4764,春秋国旅);NF-kappa-B抑制剂α (Iκ..B.α.）（1：1000稀释;＃4812，CST）。然后用与辣根过氧化物酶（HRP; 1：5000稀释;＃S0001，＃S0002，亲和力在25℃缀合的相应第二抗体探测PVDF膜70分钟，并使用ChemIdoc使用增强化学发光（P10100，NCM Biotech）观察到XRS加（Bio-rad）。使用图像实验室3.0软件分析相对蛋白表达水平。

2.7。逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

用TRIzol试剂(15596018,Invitrogen)提取HUVECs总RNA，用HiScript II QRT SuperMix (r222 -01, Vazyme)逆转录。RT-qPCR采用via7系统(Applied Biosystems)，使用All-in-One qPCR Mix (GeneCopoeia)进行40个周期检测mRNA表达水平ICAM-1那MCP-1那Interlukin-1（il - 1），Interlukin-6（il - 6),TNF-α.．GAPDH用于标准化。本研究中使用的引物显示在补充表中1．

2.8。THP-1细胞粘附分析

饥饿的HUVECs (1 × 10^5.）将其接种到12孔板中，并用Pa和/或重组人类全膜素-1（如上所述的浓度）处理24小时。培养基被替换。将THP-1细胞与10孵育 μ.M的2 '，7 ' -双-(2-羧基乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰氧基甲酯(BCECF-AM)荧光探针在黑暗中放置30分钟。收集细胞，用PBS洗涤三次，并用PBS重悬。将100 μL THP-1细胞悬液加入含有HUVECs的12孔板的孔中，共培养1 h。摈弃培养基，每孔用PBS轻洗三次。使用荧光显微镜(徕卡DM5000B)获取图像。采用Image Pro Plus 6.0软件分析HUVECs上的THP-1细胞数量。

2.9。免疫荧光的HUVECs

饥饿的HUVECs (5 × 10^4.)植入24孔板，用PA和/或重组人网膜素-1(浓度如上所述)处理24 h。摈弃培养基，用PBS冲洗细胞三次。用4%多聚甲醛固定细胞20分钟，0.5% tranton - x100渗透细胞15分钟，用正常山羊血清封闭细胞60分钟，在4°C下用针对以下蛋白的一抗孵育过夜:ICAM-1(1:200稀释;4915年代,CST);MCP-1(1:20 0稀释;GB11199 Servicebio);和NF-κB(1:20 0稀释;# 4764 CST)。然后将细胞与相应的二抗Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG H&L(1:50 0稀释;ab150077, Abcam)在37°C下加热40分钟。 The cells were stained for 5 min with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 : 1000 dilution; 564907, BD Pharmingen), and images were acquired using a fluorescence microscope (Leica DM5000B). Fluorescence intensity was analyzed using Image Pro Plus 6.0 software.

2.10。统计分析

数据显示为平均值±SEM。使用未配对的学生进行比较数据T.- 差异（ANOVA）的最低和单向分析，然后是HOC测试最低差异（LSD）。使用SPSS 19软件进行统计分析。价值<0.05为有统计学意义。

结果

3．1．Omentin-1逆转pa诱导的HUVECs增殖和迁移损伤

与对照组和DMSO处理相比，单独使用PA处理HUVECs可抑制其增殖能力(图)1（a））.与PA和Omentin-1的同时治疗部分改善了这些细胞的增殖能力受损（图1（a））.流式细胞仪结果显示，单独用PA处理后，S期和G2期细胞比例低于对照和DMSO处理后(图5)1（b））.PA可以抑制HUVEC的分裂。与PA处理相比，omentin-1处理导致S期和G2期细胞表达上调，表明omentin-1逆转了PA诱导的细胞分裂抑制(图)1（b））.划痕和transwell检测显示PA治疗对HUVECs迁移能力的损害，而omentin-1联合治疗可以减轻这种影响(图)1（c）和1（d））.这些结果表明PA可诱导内皮损伤，而网膜素-1可改善内皮损伤。

3.2。甲壳素-1将PA诱导的THP-1细胞附着到HUVEC

Western Blotting分析表明，PA治疗的Huvecs蛋白表达水平，动脉粥样硬化相关的内皮 - 白细胞粘附分子和MCP-1，重要的趋化因子显着高于对照和DMSO处理的HUVEC（数字2（a））.甲壳素-1抑制了PA诱导的ICAM-1和MCP-1表达的上调（图2（a））.pa在mRNA表达水平上诱导上调ICAM-1和MCP-1在用甲壳素-1同时处理后也抑制（图2（b））.细胞免疫荧光结果进一步证实了这些发现（图2（c）和2（d））.与对照组和DMSO治疗组相比，单独使用PA后，附在HUVECs上的THP-1细胞数量显著增加(图)2 (e)）.然而，具有胃肠蛋白-1的分配器将PA诱导的THP-1细胞的增加的增加降低到HUVECS（图2 (e)）.以上结果表明，网膜素-1可以抑制pa诱导的THP-1细胞对HUVECs的粘附，且网膜素-1抑制pa诱导的ICAM-1上调和MCP-1表达的作用，至少在一定程度上参与了这种预防作用。

3．3．Omentin-1抑制pa诱导的HUVECs炎症状态

ICAM-1和MCP-1均为NF-的靶基因κ..B;因此，我们检测了NF-蛋白的表达水平κ..B通过western blotting。因此，我们发现pa诱导了NF-表达的上调κ..B由Omentin-1 CoTreatment（图）改善3（a）），并且PA引起的致力于致力κ..B.α.omentin-1(图3（a））.因此，omentin-1抑制NF-的激活κ..B.进一步研究胃蛋白-1对NF-表达的影响κ..B，细胞免疫荧光法检测NF-的表达κ..B.结果表明，NF-的荧光强度κ..PA组的细胞中B的表达明显高于对照组和DMSO治疗组。相反，omentin-1降低了pa诱导的NF-荧光强度的变化κ..b（图3 (b)）.pa在mRNA表达水平上诱导上调il - 1那il - 6,TNF-α.， NF-的靶基因κ..网膜素-1也改善了(图3 (c)）.这些结果表明，通过预防NF-激活，全膜-1可以部分地缓解PA诱导的Huvecs的促炎状态κ..B.

4。讨论

CHD是动脉粥样硬化的最严重的临床表现之一，已成为全球卫生行业的负担[17］．作为一种慢性动脉疾病，动脉粥样硬化的特征在于脂肪牛排的外观，动脉粥样格管的发育，形成斑块。斑块本身或破裂后可能导致动脉血栓形成和闭塞，导致诱导相关器官的低渗和损伤[18］．内皮细胞在心血管系统中维持血管张力、调节炎症和血栓形成等方面发挥着重要作用[19］．病理刺激如糖尿病，高血压和血脂血症可能引发内皮细胞损伤，其特征在于正常功能的变化[20.］．到目前为止，内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发展过程中最早可检测到的病理变化之一[4.］．最近的一项研究报道了游离脂肪酸诱导内皮细胞损伤的能力体外[21］．本研究建立pa诱导的内皮细胞损伤模型，以确定网膜素-1在这一过程中的作用。

网膜素-1是一种新型的脂肪细胞因子，大量表达于EAT、网膜脂肪组织和一些其他器官[11］．虽然尚未确定甲壳素-1的特异性受体，但是已经广泛探索了麦丁-1的作用。甲壳素-1介导的心血管保护作用[22]调制胰岛素的功能[23]和受管制骨代谢[14］．最近有报道说，在循环水平和mRNA表达水平麦丁-1在冠状动脉疾病(CAD)患者中，与无CAD患者相比，在EAT中显著下调。此外，与非狭窄段相邻的EAT相比，冠状动脉狭窄段周围的EAT中网膜素-1的蛋白和mRNA表达水平较低，提示网膜素-1可能是一种抗动脉粥样硬化的脂肪细胞因子[24］．然而，其在pa诱导的内皮细胞损伤中的作用尚不清楚。

血管内皮包含连续的内皮细胞单层，并调节凝血和炎症反应[1］．内皮细胞单层的完整性对于维持这些功能很重要[24］．在本研究中，PA治疗抑制了Huvecs的增殖和迁移能力。这些能力可以提高单细胞衬里的修复，这对于血管内皮的完整性至关重要。与PA治疗相比，与甲壳素-1的分配器增加了S和G2相细胞的比例，从而刺激了Huvec划分。Omentin-1还救出了PA引起的Huvecs的迁移能力。这些发现表明Ementin-1可能有助于维持血管内皮的完整性。在单独将Huvecs暴露于Pa，ICAM-1和MCP-1的表达水平也被上调。作为内皮 - 白细胞粘附分子，ICAM-1表达水平随动脉粥样硬化病变增加[25］．MCP-1可以在病变中招募和积累单核细胞，加速动脉粥样硬化的发展[26］．与对照组和DMSO组相比，黏附分子和趋化因子表达上调导致THP-1细胞粘附HUVECs的数量增加。在动脉粥样硬化发展的早期阶段，单核细胞由于化学引诱梯度被招募到损伤的内皮细胞区域。这些细胞通过粘附分子如ICAM-1粘附到内皮细胞上，然后迁移到血管内膜，在内膜中分化为巨噬细胞，内化脂蛋白颗粒，最终成为泡沫细胞[27］．大网膜素-1可抑制pa诱导的ICAM-1和MCP-1表达水平的升高;与单独使用PA相比，omentin-1共处理HUVECs后THP-1细胞数量减少。这些结果表明，网膜素-1可能抑制单核细胞与内皮细胞的粘附。pa诱导ICAM-1和MCP-1表达上调，提示HUVECs向促炎状态转变。PA处理可提高NF-蛋白表达水平κ..B并激起了我的退化κ..B.α.．众所周知，我κ..B.α.绑定到nf-κ..B并涵盖NF-的核定位序列κ..B，其作为NF-抑制剂κ..B.不同的促炎刺激可以激活我κ..特异性磷酸化I的B激酶复合物κ..B.α.，导致I的多泛素化和降解κ..B.α.．在这种情况下，NF-κ..B可易位入细胞核，结合靶基因，包括il - 1那il - 6,TNF-α.并刺激它们的转录，最终导致HUVECs的促炎状态[27那28］．在本研究中，mRNA的表达水平il - 1那il - 6,TNF-α.与对照组和DMSO组相比，仅暴露于PA后HUVECs的表达也上调。这些促炎因子的上调进一步证实了pa诱导的NF-激活κ..B.这些炎症因子诱导单核细胞分化为巨噬细胞并加速泡沫细胞的形成[29］．nf-的激活κ..B和促炎信号传导级联被甲壳素-1的分泌物抑制。然而，这些保护效果的确切机制是未知的。以前的研究表明，Opentin-1刺激了AMP活化的蛋白激酶（AMPK）信号通路以抑制TNF-α.-诱导内皮细胞炎症状态，抑制心肌肥大，逆转心肌缺血损伤[12那30.那31］．需要进一步的研究来评估甲壳素-1对PA诱导的内皮细胞损伤作用的确切机制。CAD患者的甲壳素-1的表达水平降低[32］．增加甲虫-1表达可能会阻止动脉粥样硬化的发作和发育，并且可能是CAD治疗的潜在治疗策略。

综上所述，omentin-1可挽救pa诱导的HUVECs受损的增殖和迁移能力，减少pa诱导的HUVECs粘附的THP-1细胞数量增加，抑制pa诱导的HUVECs促炎状态。这些发现表明网膜素-1有改善pa诱导的内皮细胞损伤的能力，以及它作为抗动脉粥样硬化脂肪细胞因子的潜在作用。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者感谢中南大学湘雅医院的周阳洁，感谢她在这项研究中给予的巨大帮助。基金资助:国家自然科学基金项目(81873494(罗凡燕));国家自然科学基金项目(81974112(唐灿e));湖南省自然科学基金项目(2018JJ2665(罗凡燕))。

补充材料

本研究中使用的引物。（补充材料）

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