EphB4酪氨酸激酶刺激抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞生长的剂量和时间依赖性

摘要

背景．EphB4受体酪氨酸激酶在乳腺肿瘤中过表达，具有诊断和治疗价值。根据配体的存在或缺失，该受体具有促进和抑制肿瘤的双重功能。为了阐明这种差异，我们旨在确定时间和剂量依赖的EphB4刺激对重组ephrinB2-Fc乳腺癌细胞生存能力和侵袭能力的影响。方法．将细胞接种到多孔板上，用不同浓度的聚簇前ephrinB2-Fc刺激细胞。在不同融合状态下，分别于处理后第3天和第6天测定细胞活力。结果．在达到汇合之前，用EphrinB2刺激细胞对细胞活力的任何显着影响，同时在剂量依赖性后6天后检测到细胞生长的抑制。Ephrinb2治疗不影响图中的管状形成和侵袭。结论．本研究表明，EphB4对融合后状态的细胞具有不同程度的抑制作用，配体的存在体现了EphB4受体的生长抑制特性。因此，生长抑制可能是配体长期作用导致受体下调的结果。

1.介绍

癌细胞表达许多因素，使它们能够克服调节障碍，实现不间断的生长，并在正常细胞无法生存的异常环境中生存[1］.在这些因素中，酪氨酸激酶起到枢轴作用。Eph（产生肝癌的促红细胞素）受体包含最大的酪氨酸激酶家族，并且基于其序列同源分为两类ephas和ephbs。通过它们的膜结合配体Ephrinas和Ephrinbs发生受体活化[2］.该家族的一个显著特征是它们能够在表达受体和配体的细胞中传播双向信号;换句话说，无论是Eph受体还是ephrin配体都能够以正向和反向信号的形式诱导下游信号[3.］.由于这种空间定位，Eph受体和ephrin配体在表达其受体和配体的细胞之间构建了一个通讯系统，这使得它们能够参与许多生理过程，如增殖、形态和运动、神经元寻径过程中正常器官的生长、血管生成等[4.-7.］.

最近，他们的参与癌症等异常已经记录了[8.］.EphB4和EphA2是研究最多的癌症家族成员。与其他主要致瘤的酪氨酸激酶不同，该家族有肿瘤促进和抑制双重功能的报道[8.］.

癌细胞表达的EphB4与内皮细胞表达的ephrinB2相互作用，诱导血管生成[9.］.始终如一地，已显示可溶于刺激内皮ephrinb2配体的可溶性EphB4受体具有通过抑制血管生成降低肿瘤生长的治疗潜力[10.那11.］.此外，EphB4过表达已被证明与肿瘤分级和分期的增加相关[12.[乳房细胞中的ephb4受体过度表达Ephb4受体导致它们的转化和恶性行为的表现[13.］.因此，EphB4的下调降低了乳腺癌细胞的生存能力，提示EphB4的表达是一种生存因素[14.］.

除了癌细胞中EphB4过表达之外，肿瘤细胞中的受体磷酸化非常低，并且已经示出了EphrinB2，EphB4的优选配体，被降低，因为受体过表现出来[15.］.这导致了一种假设，即ephrinB2介导的EphB4激活以及受体和配体的平衡表达导致了肿瘤抑制[16.］.这一假设得到了Noren等人的进一步支持，他们报道了乳腺癌细胞中ephrinB2/EphB4信号下游的一个肿瘤抑制信号通路Abl-Crk的激活[17.］.

除了迄今为止迄今为止癌症eph受体的功能的新的研究之外，与其作用相关的复杂性需要更加精致地了解对肿瘤生物学的贡献，以便适当地靶向并充分利用癌症治疗中的肿瘤抑制行为。我们认为，EphrinB2治疗对乳腺癌细胞的致命作用也可能是时间和剂量依赖性。在此，我们研究了各种Ephrinb2-Fc浓度对不同汇合状态的MDA-MB-231乳腺癌细胞生长的短期和长期治疗的影响，我们测试了这种治疗对癌症侵袭行为的影响用Matrigel三维培养细胞。

2.材料和方法

2.1。试剂

EphrinB2-Fc购自R&D Systems。Fc片段和用于聚类ephrinB2-Fc的山羊抗人IgG均来自Jackson ImmunoResearch。alamarar -blue从AbdSerotec获得，matrigel购自Invitrogen公司。

2．2.细胞培养

MDA-MB-231乳腺癌细胞系来源于伊朗巴斯德研究所。细胞保存在添加了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中，并保存在5% CO的潮湿环境中₂培养箱每2-3天再次更新。在使用0.25％胰蛋白酶-EDTA达到汇合之前将细胞转培养。

2.3。Alamar-Blue活力测定的标准化

阿拉玛蓝是一种市售的resazurin盐溶液，用于测定各种培养细胞的活力和增殖能力。与四唑盐(如MTT)不同，阿拉马尔蓝染料是水溶性的，通过加入DMSO可以避免进一步的晶体增溶。此外，alamarar -blue对细胞没有毒性，可以在很长一段时间内重复测量细胞活力，使动力学研究成为可能。阿拉马尔蓝被线粒体酶转化为一种还原形式，这一过程伴随着颜色从靛蓝色到粉红色的变化，这可以通过比色法或荧光法读数来测量。

由于细胞代谢容量的差异减少了阿拉马马尔 - 蓝染料，电镀的最佳温育和电池数量是在为所用的每种细胞系进行活力/细胞增殖测定之前确定的两个临界变量[18.］.

通过胰蛋白酶-EDTA收获生长的日志阶段的细胞，并初始浓度进一步稀释后放入96孔板(200μL代表每口井)。以无细胞培养液为阴性对照，平板孵育4 h，使细胞附着。每口井中加入20微升的阿拉玛蓝。在前6小时使用PowerwaveXS平板阅读器在570和600 nm处每2小时测量吸光度。平板也培养了24小时，以测量最大染料还原。pH被严格控制在7-7.4，保持在CO中₂孵卵器测试期间。

阿拉玛蓝的减少百分比通常使用公式(1） 和在570和600nm处被记录为测试井的吸光度，和观察阴性对照的吸光度。

或者，提供公司建议的在线计算器用于测量百分比减少(http://www.abdserotec.com/）.

2.4。用于细胞活力的Alamar-Blue测定

EphrinB2-Fc配体的二聚化是必要的，以完全活化EphB4受体;因此，在实验之前，用山羊抗人均IgG在1：3浓度下在1：3浓度下进行1小时，在室温下为1小时，在室温下进行1小时。

细胞at.浓度被播种到24孔板的每孔中。24小时后，细胞在含有1、3或10的培养基中孵育μG / ML预聚类EphrinB2-FC或控制FC。

当细胞分别在亚和后常态中，测量细胞活力在第3天和6时测量。在6天测定的第3天替换含有EphrinB2-Fc的新鲜培养基。

在指定的时间用PBS冲洗细胞，更换新鲜培养基。每孔加入含10%胎牛血清的新鲜培养基，量为每孔体积的10%，孵育3小时。200年整除μL分配在96孔板中，在570和600nm下测量吸光度，使用板读数器测量。不含测试剂的细胞加Alamar-Blue作为阳性生长对照。然后基于等式计算EphrinB2-Fc和Fc处理组百分比减少差异（2)或在线计算器。 和分别在570和600 nm处观察到吸光度和被观察到阳性生长对照的吸光度，由细胞加上Alamar-Blue但没有测试剂组成。

2．5．细胞在基质上的行为

基质在冰上融化，100μ将L溶液均匀地加入冰24孔板每孔中，置于培养箱中保存30分钟。一个暂停细胞加上3和10的溶液 μ在总体积为400的每个孔中向每个孔中加入G / mL印模的ephrinB2-Fc或PBS作为阴性对照 μL和板材孵育24小时。通过倒光显微镜观察并拍摄管状形成的细胞行为。

2.6。统计分析

学生分析了ephrinb2-Fc治疗和未治疗组之间的差异 -T.-测试。进行差异分析，然后进行后HOC试验，以比较各种剂量之间的存活。数据表示为平均值±s.e.m和被认为是重要的。

结果

3．1.警报蓝活力测定的最佳条件

在不同的细胞密度和孵育期间测量与MDA-MB-231细胞系一起孵育后的Alamar-Blue的百分比，并且每个时间点绘制数据符合各种细胞浓度。曲线是线性的和 cell/mL (Figure1）.根据这些结果和确定24孔板播种细胞的最佳细胞密度的中试试验，选择细胞/mL浓度，使细胞在4天内达到汇合。以鸣笛蓝孵育3小时为最佳时间。这些值是为以后的实验选择的。

３．２．EphB4刺激以剂量和时间依赖性的方式降低癌细胞活力

通过聚簇EphrinB2刺激后受体磷酸化的分析表明，Ephb4受体在MDA-MB-231乳腺癌细胞系中有效（数据未显示）。为了确定受体激活对细胞活力和生长的影响，如前所述，在不同时间点暴露于各种剂量的聚簇EphrinB2-Fc。观察到细胞活力的显着降低，当细胞与EphrinB2-Fc或Fc控制孵育3天时，当细胞约为60％汇合并且在单层状态下生长（图2（a））.当细胞达到汇合时6天孵育后检测到显着的减少，并且继续生长为第二层;细胞活力的降低更高剂量更突出（图2（b））.这些结果表明，抑制通过EphrinB2介导的EphB4刺激介导的细胞生长仅在较长的培养时间后发生。

３．３．处理EphrinB2-Fc并不影响细胞在基质上的行为

基质胶是胶原蛋白和层粘连蛋白的混合物，层粘连蛋白是细胞外基质的主要成分。转化细胞和非转化细胞在基质上表现出不同的形态，这一特性可用于研究抗肿瘤药物逆转转化细胞行为的作用。正常细胞如MCF-10A在基质上形成球形小体，转化侵袭细胞如MDA-MD-231乳腺癌细胞系侵入基质形成管状网。

我们测试了Ephrinb2-Fc治疗是否可以抑制Matrigel上MDA-MB-231的管状网络形成。在precressed ephrinb2-Fc存在下将细胞在Matrigel上孵育24小时（检查3 μg / mL和10μ克/毫升浓度)。MDA-MB-231细胞侵入基质形成管状网络。任何测试剂量的EphrinB2;没有改变细胞的侵入行为，如图3.．如Carles-Kinch等人所示，如果ephrinB2处理影响基质细胞的侵袭行为，则预期管的形成将完全消失，并将看到聚集的集落而不是小管[19.］.这些结果表明，通过EphB4刺激所观察到的6天后细胞活力下降不太可能是由于特定的抑制多层生长阶段，即锚定独立生长。

4.讨论

Eph受体家族是分子癌症治疗的有趣靶点，因为它们大多在肿瘤中过表达，似乎参与了肿瘤细胞的生存和增殖、侵袭、转移和血管生成。因此，设计合适的靶向药物可以通过多种机制诱导肿瘤生长停滞。然而，合理的药物设计需要更准确地了解Eph/ephrin系统在肿瘤细胞及其微环境中的信号转导机制，才能充分发挥其抑制肿瘤生长的作用。

在本研究中，我们发现长期用ephrinB2-Fc孵育MDA-MB-231乳腺癌细胞，当细胞在融合后状态下生长时，其生长受到抑制，并且在高剂量下生长抑制更为明显。Carles-Kinch等人的一项类似研究显示，使用针对EphA2 (Eph家族的另一个成员，在MDA-MB-231细胞系中过表达)的激活抗体，可抑制细胞达到融合后的生长，并抑制基质上的管状形成[19.］.

6天后抑制细胞生长可能是由于受体下调和从细胞表面缺失而不是抑制锚固无关生长。Kumar等人在类似的研究中看到了这种机制。其中他们表明，长期治疗MCF-7细胞与EphrinB2导致受体下调和生长抑制，类似于EphB4的敲低的结果[14.］.另一方面，随着本研究中使用的条件，EphrinB2-Fc治疗没有减少小管和侵袭的形成。因此推测，EphrinB2-Fc更可能肿瘤细胞活力的抑制剂，并且肿瘤侵入的还原可能需要更高的剂量或在活的有机体内抑制血管生成导致抑制侵袭和转移的情况。

最近的研究已经发现乳腺癌中EPH受体的有趣方面，EPH / Ephrin在促进或抑制肿瘤中的精确作用仍然尚不清楚。肿瘤促进和抑制的双重作用（图4.)，可能是基于同源配体的存在或缺失[13.］.因此，EphB4过表达与肿瘤分期增加和生存期降低相关[20.］.因此，EphB4可能作为乳腺癌细胞的生存因子，这可能是由于构成性激活或与其他致癌生长因子受体(如EGFR家族)的串扰[14.］.相反，在乳腺癌细胞中，通过配体ephrinB2激活EphB4已被证明通过激活Abl-Crk通路抑制肿瘤的促进和侵袭，这与我们的结果一致[17.］.

然而，要描述单独存在或不存在ephrinB2刺激EphB4所产生的相反作用，情况似乎要复杂得多。在这方面，细胞环境似乎也在决定肿瘤促进或抑制的作用中发挥了关键作用。这一假设最近在Xiao等人的一项研究中得到了支持，他们证明了ephrinB2-Fc处理导致HUVEC细胞的生长抑制，而同样的刺激导致MCF-7细胞的生长促进[21.］.关于EphB4受体在乳腺癌中的作用的悖论甚至更进一步，在它们指定的信号机制中也很明显。Kumar等人之前的研究表明，通过ephrinB2刺激EphB4会激活PI3 K/Akt通路，而用配体处理MCF-7细胞4天会导致细胞因受体下调而死亡[14.］.另一方面，Xiao等报道了6天后由于Ras/Erk通路的激活导致ephrinB2处理后MCF-7细胞的生长增加[21.］.在相同的背景下，这种差异可能是由于实验条件的变化，如受体刺激的配体剂量和时间，这在我们的研究中也被证明是有效的，以及配体与抗fc抗体聚类的程度或使用的生存检测的敏感性。在不同的刺激条件下，从生长抑制到促进反应的依赖性进一步完善了靶向乳腺癌中EphB4的智能药物设计，因此需要进一步的研究，以更准确地解决各种癌症中激活EphB4比抑制EphB4的优势。

利益冲突

两位作者没有利益冲突。

作者的贡献

Mona Moshayedi和Farnaz Barneh在这项研究中同样贡献。

金融支持

这项研究得到了伊斯法罕医学科学大学研究委员会的资助。

承认

作者感谢Nasim Dana(应用生理学研究中心)提供的基质。

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