多肽酶活性在甲状腺肿瘤和增生中的变化

摘要

背景。乳头状甲状腺癌（PTC），卵泡甲状腺腺瘤（FTA）和甲状腺结节性增生（TNH）是甲状腺最常见的疾病。以前的研究描述了二肽基肽酶IV（DPPIV / CD26）在甲状腺肿瘤的发育中的涉及，并提出其作为这些疾病的诊断/预后的额外工具。然而，很少是关于其他肽酶在该腺体的肿瘤和增生过程中的参与。方法。在肿瘤和Nontumour相邻组织中氟常慢地测定10次PTC，10FTA和14HH中的10个肽酶的催化活性。结果。PTC中DPPIV/CD26活性明显高于FTA、TNH和非肿瘤组织。与非肿瘤组织相比，甲状腺肿瘤组织中天冬氨酸氨基肽酶(AspAP)、丙氨酰氨基肽酶(AlaAP)、脯氨内肽酶、焦谷氨酰基肽酶I和氨基肽酶B活性显著升高。PTC的AspAP和AlaAP活性也显著高于FTA和TNH。结论。这些数据提示DPPIV/CD26和一些胞质肽酶参与了PTC和FTA的肿瘤发展。进一步的研究将有助于确定AlaAP和AspAP在甲状腺肿瘤诊断和预后中的可能临床应用价值。

1.介绍

甲状腺的孤独和多个结节在临床实践中非常常见，其中大部分是良性病变，甲状腺结节性增生（TNH）或滤泡甲状腺腺瘤（FTA）。大概只有5％的甲状腺结节是恶性的[1]，其中70%为乳头状甲状腺癌(PTC) [2］.超声检查进入常规实践后，发现了大量不可触及且临床上无症状的甲状腺结节。TNH、FTA和PTC可根据完善的组织病理学标准进行区分[3.］.有趣的是，这些病变可以通过超声引导下的细针穿刺细胞学检查获得公认的诊断成功[1]或通过核心活检[4.］.

TNH由多个大小不等的结节组成，由形状奇特的甲状腺滤泡组成，细胞学呈均匀无刺激性，部分包封，当激素刺激停止时，包封可能逆转并消失。甲状腺功能亢进很常见。

FTA通常出现为无症状孤零零节结节。这种病变由小尺寸的卵泡组成，含有纤维状，有时是水肿的基质，并且显示出明确定义的纤维囊。这些肿瘤中没有血管或囊状侵袭的证据;否则，病变被认为是癌[3.］.

PTC是最常见的内分泌癌类型，并显示出多种临床介绍。大多数患者在首次咨询时患有甲状腺结节，但其他一些其他患者没有，颈部淋巴结转移是甲状腺遗骸肿瘤的唯一表现形式。组织学上，PTC可以显示出非常不同的增长模式[5.那6.]，其诊断依赖于识别特征核特征，如核扩大，核膜不规则，外周染色质谱和显着的微核酮[3.］.

类似HBME-1，细胞角蛋白19和Galectin-3等免疫组织化学标志物可能有助于困难的情况下[6.］.

通过水解它们的特定肽酶来调节生物活性肽。这些肽转化酶分布在主要人体组织中，并且最初被认为仅涉及蛋白质和肽清除[7.］.然而，许多研究表明，它们参与多种生理功能，并通过调节生物活性肽的活性，降解细胞外基质，在许多细胞系统的生长控制、分化和信号转导中发挥关键作用。作为粘附分子直接参与细胞内信号传导[7.-10］.因此，这些酶的表达和催化功能模式的改变可能会导致一些疾病过程，包括肿瘤转化和肿瘤进展[8.-10］.

对甲状腺肿瘤潜在病理生理学的理解的增加，导致在其发生、生长和传播中涉及多种蛋白酶[11-16］.金属蛋白酶如MMP-2和9和肽酶如二肽基肽酶IV / CD26（DPPIV / CD26）在这些肿瘤中改变它们的表达和活性，并已被认为是甲状腺肿瘤的诊断中的分子标记[11-18］.然而，关于甲状腺肿瘤和增生疾病中其他肽酶的活动模式，很少熟知。

本研究旨在分析PTC，FTA和TNH和邻近的非肿瘤甲状腺组织中不同肽酶的活性，因为我们之前在其他肿瘤中进行，例如肾，结直肠和头部和颈部肿瘤[19-23］.出于这种目的，我们在这些病变中分析了覆盖整个肽转化活性的10酸，碱性，中性和ω肽酶的活性。一方面，我们选择了五个细胞表面肽酶-DPPIV / CD26，APN / CD13，NEP / CD10，APA和帽 - 已被描述为血液学，肾脏，皮肤，前列腺癌中的肿瘤标志物，包括肿瘤标志物，其中其他 [8.-10那24］.另一方面，为了更好地了解这些酶是否也可能参与肿瘤的发展，我们选择了5种胞质酶——pep、alaAP、AspAP、APB和pgi。“

2。材料和方法

作者宣布本研究中开展的所有实验符合当前的西班牙语和欧盟法律规定。

２.１.组织标本

30个PTC、14个TNH和10个FTA及其对应的非肿瘤区域的代表性组织在手术切除后的前30分钟内，在病理实验室新鲜充分取样，立即用异戊烷冷冻，并在−80°C保存，直到进行酶分析。患者的个人数据被适当加密，以确保所选材料的匿名使用符合国际建议。

２.２.样品制备

在Zambotti-Villela等人的改性版本之后获得可溶性和膜结合级分。[25］.移植组织样品在pH 7.4的10 mM Tris-HCl缓冲液中，使用Heidolph PZR 50 Selecta均质器在800 rpm下均质30秒，并在centrkon T-2070 Kontron Instruments仪器在100,000 ×g下超离心35分钟。上清用于测定可溶性酶活性:APB、AspAP、PG I、PEP和AlaAP。为了避免可溶性酶的污染，将产生的微球在pH 7.4的10 mM Tris-HCl缓冲液中悬浮三次，然后在pH 7.4的10 mM Tris-HCl缓冲液中均质，并在低速(800 ×g)离心3分钟以净化样品。上清用于测定膜结合酶活性:APA、APN/CD13、CAP、DPPIV/CD26和NEP/CD10。所有步骤都在4°C下进行。

2.3。酶测定

采用Yoshimoto等人所描述的方法，用饱和浓度的氟源衍生底物孵育样品来测定肽酶活性[26]，Mantle等人。[27]和silveira等。[28］.所选的肽酶，它们的底物，和反应条件的每个酶分析总结在表中1．

用Ala-测定3个重复的丙氨酸氨基肽酶(AlaAP和APN/CD13)活性β-萘胺作为底物。与特异性AlaAP抑制剂嘌呤霉素孵育(40μ.M)同时进行，以区分AlaAP和APN/CD13形式的总丙氨酸氨基肽酶活性。用H-Gly-Pro-检测DPPIV/CD26和PEP活性β-naphthylamide, Z-Gly-Pro -β-naphthylamide分别。用Arg-测定APB(碱性)和酸性氨肽酶(AspAP, APA)活性β-naphthylamide Asp -β- 萘酰胺，和胶水β- 分别是萘酰胺基材。ω肽酶（PGI）活性使用PGLU荧光测量β- 萘酰胺作为底物。使用L-Cystine-di-分析帽活动β- 萘酰胺。通过将样品孵育具有饱和浓度的N-丹酰-D-ALA-GLY-PNO来进行NEP / CD10测定₂-phe-gly（dagnpg，丹酰衍生物）。这些测定基于由酶从底物水解产生的产物的荧光。

反应开始于加入30-50μ.L的样品到1ml的适当孵育混合物取决于酶和底物分析如下:AlaAP, APN/CD13, APB, PEP和PGI的活性(50 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4的AlaAP, APN/CD13，和PGI的活性，pH 6.5的APB，和0.125 mM氨基酰-β- 萘酰胺）;ASPAP，APA，DPPIV / CD26，帽和NEP / CD10活性（适用于ASPAP，NEP和APA的50 mm TRIS-HCL缓冲液，pH 8.3，用于帽的pH 5.9，0.125 mm氨基酰基 - 0.125mmβ[D]AG (pN) PG)。

37℃孵育30分钟后，向混合物中加入1 mL 0.1 M乙酸钠缓冲液(pH 4.2)终止反应。通过测量荧光强度(412 nm, 345 nm)来测定释放产物β用岛津RF-540荧光分光光度计测定[D]AG)，在562 nm处，激发波长为342 nm。空白由缓冲液(而不是样品)和相同的反应物组成，用于测定背景荧光。相对荧光转化为产品的皮摩尔使用标准曲线构建的浓度增加β- 萘胺或[D] Ag。

以DPPIV和PEP为例，验证其形成β- 萘基氨基特别是由于这些肽酶的作用而不是由于其他酶，其可以切割相同的基材（H-Gly-Pro-β- na由DPP8、DPP9和Z-Gly-Proβ- 通过Seprase），我们用特异性抑制剂进行抑制测定（DPPIV和PEP-2047的Diprotin A和PEP）。在PTC中抑制87％的DPPIV活性，在TNH中为94％，在FTA和未凝固的甲状腺组织中100％。在PEP的情况下，测量的95％的活性对肿瘤和非肿瘤组织中的抑制剂敏感。因此，我们得出结论，释放β- 两种情况下的萘胺主要是由于DPPIV和PEP。

2.4。蛋白质测定

用Bradford法测量三次重复的甲状腺组织可溶性和膜结合组分的蛋白浓度[29]，以牛血清白蛋白(1mg /mL)为校准器。结果以每毫克蛋白质的肽酶(UP)单位记录(1单位肽酶(UP)等于每分钟释放1pmol萘胺)。荧光测定与水解时间和蛋白质含量呈线性关系。活性表示为pmol的产物/min/mg蛋白(UP/mg蛋白)，报告为平均值±SE。

2.5。统计分析

Shapiro-Wilk测试应用于从肿瘤样本获得的数据，以知道数字是否遵循正常分布。基于此信息，非参数曼 - 惠特尼和Kruskal-Wallis测试分别用于检测两组与两组以上的差异。SPSS 19.0软件用于统计分析。

结果

以女性为主:PTC组有6名男性，24名女性(平均年龄53.7岁)，FTA组有3名男性，7名女性(35.4岁)。TNH组14例均为女性(43.2岁)。

PTC组的组织病理学分型包括常规PTC(16例，53,3%)、滤泡变异型PTC(10例，33,3%)和乳头状微癌(4例，13,3%)。在80%的病例中发现了器官限制疾病(pT1/2)。6例出现轻微囊外扩张(pT3)， 2例出现局部淋巴结转移。

表格2显示在增生，肿瘤和Nontumour邻近组织的可溶性和膜结合级分中测量的所有肽酶活性。

aspap，pg i，pep和Alaap的细胞溶质馏分活性在PTC中显着增加（表2（a））和FTA（表2（b））与邻近的非南瓜组织相比。在两个肿瘤中也增加了APB活性，尽管这种变化在PTC中没有达到统计学意义。与非血浆组织相比，在TNH组织中的这些肽酶的活性没有显着变化（表2（C））。

在PTC中，DPPIV/CD26的膜结合组分活性显著升高(表)2(a))和较低的自由贸易协定(表2（c）），与Nontumour组织样品的参考相比。相比之下，在测试的其他膜结合活动中没有发现显着的变化。TNH组织没有产生重大变化。

最后，当相互比较三种甲状腺病变时，DPPIV / CD26，AlaAP和Aspap在PTC中表现出显着更高的PTC活性，而不是FTA和TNH（图1）.其余分析的肽酶没有显著结果。

4。讨论

据报道，蛋白酶的表达和活性模式，例如MMP和肽酶，在恶性肿瘤中改变，表明它们在肿瘤细胞生长，局部侵袭和转移中的含义[8.-10］.在甲状腺肿瘤中，与非肿瘤组织相比，MMP-2和9在肿瘤组织中上调，这表明这些酶可能在甲状腺肿瘤转化中发挥作用[14那15］.这些MMP和肽酶如DPPIV / CD26在几个甲状腺肿瘤中明显地表达，并且已被提出为有用的诊断/预后甲状腺肿瘤标志物[14-18］.

同样地，我们观察到PTC和FTA中几种肽酶活性被选择性修饰，与非肿瘤邻近组织相比。因此，胞质多肽酶在两种肿瘤中均表现出较高的活性，而DPPIV/CD26活性在PTC中显著升高，而在FTA中较低。由于TNH的肽酶活性没有任何变化，这些结果表明这些肽酶在甲状腺肿瘤的发展中发挥作用。

有趣的是，肽酶活性在甲状腺病变中明显改变。一些作者强调，肽酶可能促进或阻碍肿瘤的发展取决于特定类型的肿瘤或肿瘤所在的发展阶段，这种方式表明，肿瘤生长调节的多肽及其转换肽酶发生在肿瘤特定的方式[8.-10］.我们在先前的研究中表现出不同肿瘤的肽酶活性的选择性变化[19-23］.例如，当将这些与未凝固的组织进行比较时，肾细胞癌中的APN / CD13和ASPAP活性减少[19头颈部鳞状细胞癌增多[20.］.而且，较高的APN/CD13活性与高级别肾细胞癌相关[19而这些患者的存活率较低[22］.观察到的趋势的一个例外可能是PEP，其活性在迄今为止研究的大多数肿瘤组织中都增加了[23那30.-32］.

最近的数据显示DPPIV / CD26是甲状腺病理学中恶性肿瘤的有用标志物[16］.先前的研究已经证明这种丝氨酸异肽酶在滤泡细胞来源的甲状腺癌中特异性表达[17那18］.这些研究中的一些已经通过半致细胞酶方法进行，并在PTC中显示了最高的活性[16-18］.我们的荧光定量分析也得到了类似的结果，表明PTC中的DPPIV/CD26活性明显高于FTA和TNH。这些经验表明，该酶可作为一种潜在的甲状腺癌标志物。有趣的是，在我们的分析中，AlaAP和AspAP是其他与DPPIV活性模式相似的酶。这一结果为肽酶作为甲状腺肿瘤标志物的研究开辟了新的可能性。

DPPIV / CD26是一种呈现众所周知的脂肪效应的糖蛋白，这可能与这种酶在不同肿瘤中显示的各种角色有关。提出了两个主要动作机制：一方面，其对生物活性肽的催化活性，如物质P，生长激素释放激素和几种在癌症生长调节中起作用的趋化因子和白细胞介素[33另一方面，通过其与细胞外基质的某些分子的直接相互作用[34］.这些不同的行动使得难以确定DPPIV / CD26在癌症中发挥的确切作用，并需要进一步调查来阐明它们[24］.

在癌变过程中，许多发生在细胞生理上的基本改变是通过细胞外信号通路与细胞内回路相互作用介导的。因此，细胞表面和细胞内分子在癌症病理生物学中都发挥着关键作用[35］.几位作者指出了肽酶在细胞内或细胞内水平的细胞和肿瘤中的特定作用36-40］.

AlaAP和APB参与细胞凋亡和细胞周期调节，这些酶的抑制剂如bestatin是化疗药物的潜在候选药物[38］.另一方面，细胞溶质PEP在显影组织中的高活性，其在增殖细胞和肿瘤中的细胞核周围的细胞定位，以及PEP抑制剂的DNA合成似乎涉及细胞增殖和分化中的该酶[39-43］.以前的研究还提出了aspap，pgi和其他可溶性肽酶在不同肿瘤过程中的作用[19-22那36］.我们在甲状腺瘤中检测到非肿瘤组织中的这些肽酶的较高活性指向甲状腺肿瘤中的细胞溶质肽酶的作用。

肽酶最广为人知的功能是生物活性肽的转化。除了DPPIV/CD26，胞质AlaAP、PEP、AspAP和PGI转化的几种多肽参与细胞生长和增殖紊乱[44-48例如，血管紧张素可由AspAP和PEP水解，阿片肽可由alaAP水解，白三烯A4可由APB水解，TRH可由PGI和PEP间接水解。然而，可溶性肽酶在调节与增殖紊乱相关的生物活性肽方面的作用并不像细胞表面肽酶那样清楚。尽管PEP、APB和其他可溶性肽酶分泌到细胞外间隙已被认为是一种可能的肽调节机制[49-51]，积累有利于细胞内运输和某些肽和蛋白水解酶称为肠内作用的蛋白质[52-54］.因此，有人认为上述生物活性肽也可能作为胞内因子在细胞内空间诱导细胞增殖和多种组织血管生成[52-54］.因此，不应排除在甲状腺肿瘤中，增加细胞源肽酶活性增加细胞源肽酶活性的想法。

总之，该研究分析了PTC，FTA和TNH中几种肽酶的活性，并表明细胞表面肽酶（DPPIV / CD26）和几个细胞溶化酶（PEP，APB，ASPAP，ALAAP和PGI）的潜在作用甲状腺肿瘤。然而，需要进一步的研究来定义肽酶在这些肿瘤的病理学中的确切参与及其可能的临床有用性。

缩写

APA：	氨肽酶一
APN / CD13：	氨肽酶N / CD13
aspap：	天门冬氨酰氨肽酶
APB：	氨肽酶B
DPPIV / CD26:	Dipeptidyl肽酶IV / CD26
NEP / CD10：	中性肽链内切酶/ CD10
动员:	Prolyl肽链内切酶
PGI：	Pyroglutamyl肽酶I.
AlaAP:	嘌呤霉素敏感醛氨基肽酶
帽子:	半胱氨酸氨基肽酶
MMP：	基质金属蛋白酶
PTC：	乳头状甲状腺癌
FTA：	卵泡甲状腺腺瘤
TNH：	甲状腺结节性增生。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

伦理批准

巴苏尔托大学医院伦理委员会批准了这项研究(CEIC 11/51)。

致谢

作者希望感谢Arantza Pérez(巴斯克地区大学)对这项研究的技术贡献。这项工作得到了巴斯克政府拨款(Saiotek SA-2010/00)和UPV/EHU (UFI 11/44)的支持。

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