SEPT9基因甲基化作为肝细胞癌的非侵入性标记

摘要

背景．早期发现似乎是提高肝细胞癌(HCC)患者总体生存率的最有效方法。我们评估了等离子体的潜在性能SEPT9甲基化（MSEPT9）作为非侵入性生物标志物，用于诊断HCC患者。方法．共纳入373名受试者，其中104名HCC患者、95名高危疾病患者和174名健康对照组(HC)。甲基化荧光定量PCR检测mSEPT9的甲基化程度。以单盲方式评估血浆mSEPT9对HCC的诊断性能。结果．ROC曲线显示mSEPT9与HC相比，其ROC曲线下面积(AUROC)为0.961，敏感性为82.7%，特异性为96.0%，可用于肝癌的检测和鉴别。结果表明，血浆mSEPT9的诊断效果优于血清甲胎蛋白(AFP) (AUROC为0.881，敏感性为57.7%，特异性为98.3%)。在早期HCC的检测中也发现了类似的结果。联合血清AFP检测HCC和早期HCC的灵敏度分别为91.3%和87.7%。值得注意的是，术后血浆mSEPT9水平显著下降( )．结论．等离子体SEPT9甲基化可作为诊断HCC的一种有用的、无创的生物标志物，并可用于评价HCC治疗的疗效。

1.介绍

肝癌目前是全球第六大最常见恶性疾病和第四大癌症死亡原因，每年约有84.1万例新发病例和78.2万例死亡[1］．在中国，肝癌的发病率和死亡率在新诊断的癌症病例和癌症死亡中分别排名第四和第二，约占全球新病例和死亡的一半[2］．肝细胞癌（HCC）是最常见的肝癌形式，它与肝硬化，慢性感染与乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）密切相关，以及代谢和酒精性肝病[3.］．尽管这种癌症的诊断和治疗有所改善，但预后和生存率仍然很差，5年生存率低于30%。这主要是由于HCC患者诊断较晚，错失了接受最佳治疗的机会[4.］．早期发现和接受治疗似乎是提高肝癌患者总体生存率的最有效方法[5.］．

目前，血清甲胎蛋白(AFP)测定和超声检查(US)是检测和诊断HCC的主要方法[6.］．然而，AFP因其在常用的20 ng/mL临界值下的灵敏度较低(25-65%)而受到质疑[7.］．此外，美国对早期HCC的敏感性似乎与血清AFP相似，并在很大程度上依赖于肝硬化的存在、肿瘤的大小、设备和检查专家的专业知识。因此，血清AFP和US并不是早期诊断HCC的理想方法，迫切需要新的有效的生物标志物。

最近有报道称，HCC的特征是多种遗传和表观遗传变化[8.］．与遗传修饰相比，表观遗传修饰不改变DNA序列，但它们改变DNA构象和表达，这在肿瘤发生和进展中起重要作用[9.］．DNA超甲基化是一种表观遗传修饰和早期癌症事件，可以在血浆来源的细胞游离DNA中检测到，使其成为早期检测和癌症分期的理想和有用的生物标志物[10］．许多研究表明，特定基因的DNA甲基化分析，例如p16那p15那RASSF1A基因那APC,SOCS1，可用于HCC患者的早期发现和诊断[10那11］．然而，到目前为止，还没有循环表观遗传生物标志物被批准在个体水平上诊断HCC。

这septin9基因（SEPT9)甲基化试验是美国食品和药物管理局(US FDA)批准的首个作为结直肠癌筛查试验的基于血液的甲基化试验[12］．以前的研究表明SEPT9在细胞分裂中发挥关键作用，是一种候选肿瘤抑制基因，其高甲基化与致癌物相关[13那14］．SEPT9表达经常通过肝癌中的异常促进剂高甲基化沉默，并且它是肝癌中的重要阶流基因[15］．最近，有报道称在肝硬化患者中SEPT9甲基化（MSEPT9）试验构成有望的循环表观遗传生物标志物，用于个体患者水平的HCC诊断[16］．考虑到中国人群肝癌的潜在病因与欧洲人群不同，本研究旨在调查是否SEPT9甲基化可在中国人群的肝癌患者血浆中检测，并可作为肝癌检测的一种无创标志物。

2.材料和方法

２.１.研究设计和患者选择

在本研究中，有肝脏恶性肿瘤体征和症状的患者，包括104例肝细胞癌(HCC)患者，95例高危肝病(肝硬化、肝炎和局灶性结节性增生)患者，2018年7月至2019年1月，在首都医科大学北京地坛医院进行体检后被认为健康的174名健康对照组(HC)被纳入。所有参与者提供血浆样本，采用盲法测量msep水平。最终的诊断结果是基于至少两种成像方法(超声、CT和MRI)和组织病理学确认。同时患有肿瘤、转移性癌或病理状态不明的患者被排除在外。同时收集15例HCC患者术前和术后10天的血浆，以评估血浆mSEPT9的术后预后价值。所有研究对象，包括199例患者和174名健康对照者，同时进行了AFP检测。本研究中AFP的正常范围为0-20 ng/mL，大于20则为异常。本研究经首都医科大学附属北京地坛医院伦理委员会批准，所有受试者均获得知情同意。

2.2。样品收集和存储

标准操作规程和采血按前面所述进行[17］．每个受试者静脉采血10ml，采用K₂EDTA抗凝管(BD Biosciences, USA)。取血后4小时内，室温离心(1350 g, 12 min)分离血浆。血浆标本再次离心(1350 g, 12 min)，去除残留血细胞。样本的存储和运输遵循Septin9基因甲基化检测诊断试剂盒(BioChain (Beijing) Science and Technology, Inc, Beijing, P.R. China)的用户手册进行。样本质量评估如前所述[18］．

２.３.定量甲基化特异性PCR (qMSP)用于SEPT9检测

DNA提取和亚硫酸氢盐转换是按照诊断试剂盒的制造商说明手动进行的Septin9基因甲基化检测(BioChain (Beijing) Science and Technology, Inc, Beijing, P.R. China)在ABI7500 PCR装置(Life Technologies)上进行实时PCR，扩增亚硫酸氢盐处理的DNA模板中的甲基化靶序列。对60例进行PCR检测μ.L PCR与25μ.L的模板DNA，并运行反应系统。该过程包括在94°C下初始激活30分钟，随后在62°C下激活5秒，55.5°C下激活35秒，93°C下激活30秒，然后在40°C下冷却5秒。在定量甲基化特异性PCR中，β肌动蛋白（ACTB)作为内部控制，以评估输入DNA的数量和PCR扩增的有效性。每个批次样品的有效性是在甲基化的基础上确定的SEPT9和ACTB阳性和阴性对照的循环阈值(CT)值。试剂盒中提供阳性和阴性对照，并与每次样品并行运行。以临床血浆标本为例，检测并优化检测阈值和反应因子。

２.４.统计分析

采用SPSS 20.0软件(IBM Corporation, Armonk, NY)进行统计分析，采用GraphPad Prism 5.0 for Windows进行图表绘制。各组血浆SEPT9甲基化检测CT值的差异使用Student 's进行分析测试。利用Fisher试验分析HCC患者血浆mSEPT9状态与临床病理参数之间的关系。评估…的诊断性能SEPT9在HCC或早期HCC与HC或高危疾病之间，基因甲基化单独或联合AFP，使用logistic回归评估模型。在此之后，新的变量预测概率( ）采用受试者工作特征曲线(ROC)分析。中华民国曲线下面积来计算相应的生成(auc) 95%可信区间(CI),敏感性,特异性,阳性预测值(PPV),阴性预测值(NPV),和准确性SEPT9基因的甲基化单独或结合法新社HCC诊断的截止值决定的。对HCC患者疗效评价的差异进行了配对评估测试。双尾概率 被认为是统计学意义的。

3.结果

３.１.不同人群血浆DNA中SEPT9的甲基化状态

这SEPT9对104例HCC患者、95例高危疾病患者和174例健康对照(HC)的血浆中启动子甲基化(mSEPT9)状态进行了检测。参与者的基本特征见表1．由于使用测定对于大多数正常对照未检测到基线特性，因此对于未检测到的样品，循环阈值（CT）值设定为45（测定中的PCR循环的最大数量）。HCC患者中MSEPT9的CT值显着低于HCS（HCC与HCS， ）在高危疾病患者中(HCC vs.高危， ）,建议HCC患者血浆中MSEPT9升高（图1和表S1)．我们也用Wilcoxon-Mann-Whitney检验分析了相同的数据，得到了相同的结论(图)S1)．

3.2。血浆MSEPT9在HCC和早期HCC患者中的诊断价值

为了达到所观察到的检测效果，我们使用ROC曲线分析来评估mSEPT9诊断HCC的曲线下面积(AUC)、敏感性和特异性，并确定mSEPT9诊断HCC的最佳CT截断值。与HC相比，AUC估计为0.961 (95% CI 0.933-0.989)， mSEPT9在CT截断值41时的敏感性为82.7%(86/104)，特异性为96.0%(167/174)。阳性预测值(PPV)为92.5%，阴性预测值(NPV)为90.3%，准确率为91.0%(图1)2(一个)和表2)．在HCC患者和高危疾病患者之间的比较也得到了类似的结果。AUC估计为0.843 (95% CI 0.787-0.899)， mSEPT9在CT截断值41时的敏感性为82.7%(86/104)，特异性为83.2%(79/95)。此外，PPV、NPV和准确率分别为84.3%、81.4%和82.9%(图)2 (c)和表2)．

HCC晚期(C/D期)患者血浆mSEPT9的CT值明显低于HCC早期(A/B期)患者( 那数字1），这表明血浆MSEPT9与HCC恶性肿瘤呈正相关。ROC曲线表明，与HC参与者相比，血浆MSEPT9在早期HCC患者的诊断中表现出显着的性能（AUC 0.946,95％CI 0.907-0.985，灵敏度76.7％和特异性96.0％），以及- 疾病（AUC 0.799,95％CI 0.730-0.868，敏感性76.7％，特异性为83.2％）（图2 (b)和2 (d)和表2)．所有这些结果表明，血浆MSEPT9可用作诊断HCC的优异生物标志物和临床环境中早期HCC的检测。

3.3。将血清AFP浓度和血浆MSEPT9与HCC患者及早阶段HCC患者结合的诊断价值

血清AFP是HCC检测和诊断中最被接受和使用的生物标志物。本研究评估血浆mSEPT9、AFP及其联合诊断的鉴别诊断效能。结果表明:使用血清AFP (AUC 0.881, 95% CI 0.833-0.928，敏感性57.7%，特异性98.3%)，血浆mSEPT9 (AUC 0.961, 95% CI 0.933-0.989，敏感性82.7%，特异性96.0%)，或两者联合使用(AUC 0.986, 95% CI 0.974-0.999，敏感性91.3%，特异性91.3%)。和特异性94.8%)显著提高了健康人HCC的诊断能力(图2(一个)和表2)．在HCC和高危疾病之间的诊断也显示，血浆mSEPT9和联合治疗比单纯AFP更敏感(图)2 (c)和表2)．

在比较早期HC对照组患者和高危疾病患者时也得到了类似的结果。在20 ng/mL的临界值下，AFP区分早期HCC和HC的AUC (0.852, 95% CI 0.789-0.914)敏感性为52.1%，特异性为98.3%。血浆mSEPT9联合血清AFP提高了AUC (0.980, 95% CI 0.962-0.999)和敏感性(87.7%)，降低了诊断特异性(94.8%)(图)2 (b)和表2)．在早期HCC和高危HCC之间的诊断也显示，血浆mSEPT9和联合治疗比单纯AFP更敏感(图)2 (d)和表2)．

对照组和各HCC分期血浆mSEPT9和血清AFP阳性检出率如图直方图所示3.．有一个趋势，血浆mSEPT9检测出更多的晚期HCC病例比早期HCC病例(图3.)．将血浆mSEPT9检测与血清AFP检测相结合，可提高检测HCC的敏感性。这些结果表明，mSEPT9检测在机会筛选的各个阶段对HCC均具有较高的敏感性。当考虑AFP状态时，发现AFP阴性和AFP阳性HCC患者mSEPT9诊断的阳性率相当(79.5% vs. 85.0%， ）（数字4.)，提示mSEPT9在HCC病例中的诊断与AFP状态无关。这些结果表明，血浆mSEPT9可以补充afp阴性HCC和afp限制HCC患者的诊断，具有显著的鉴别性能。

3.4。血浆MSEPT9与HCC患者临床病理特征的相关性

血浆mSEPT9与HCC患者临床病理特征的相关性见表S2．血浆mSEPT9未校正性别、血清AFP水平或HBeAg状态。血浆mSEPT9在老年患者(>50)和晚期HCC中比年轻患者( ）以及早期疾病( )．

3.5。血浆MSEPT9可以监测HCC患者治疗的疗效

反映患者病情的生物标志物的动态变化可以为医生提供临床指导。本研究评估了15例手术患者的配对血浆样本中mSEPT9水平(CT值)。术前mSEPT9平均CT值为37.9(范围:29.1 ~ 43.7)，术后10 d mSEPT9平均CT值为42.2(范围:36.3 ~ 45.0)。 那 ）（数字5.)．此外，13例术前mSEPT9阳性(CT<41)患者的CT血浆mSEPT9值在术后10天显著下降。因此，肝癌患者血浆mSEPT9水平的动态变化可用于监测治疗效果。

4。讨论

在HCC的诊断中，血浆MSEPT9表现出显着的敏感性和特异性在HCC患者中检测，即使在来自健康个体的早期阶段和风险疾病的患者中也是如此。结合血清AFP，等离子体MSEPT9表现出比单独的AFP敏感性优异的敏感性，以区分HCC患者。血浆MSEPT9可用于赞扬AFP阴性HCC和AFP限制性HCC患者的诊断，具有显着的辨别性能。此外，HCC患者血浆MSEPT9水平的动态变化可用于监测治疗的功效。这些发现表明，血浆MSEPT9可用作HCC患者的非侵入性诊断生物标志物。

DNA高甲基化是癌症发生中的重要事件，可在血浆来源的细胞游离DNA中检测到，这使其成为早期检测和癌症分期的理想和有用的生物标志物。许多研究表明，特定基因的DNA甲基化分析可以用于癌症的早期诊断，如大肠癌中的血浆mSEPT9 [19，支气管肺泡灌洗液Shox2.和RASSF1A基因在肺癌方面，[20.),和尿液问题前列腺癌[21］．然而，没有FDA批准的循环表观遗传生物标志物已被证明可用于诊断HCC。

Septins是一种进化保守的GTP酶的GTP酶，不同功能包括细胞因子，囊泡贩运，细胞凋亡和细胞极性的维持中的作用22］．SEPT9，是septin家族的一员，在致癌过程中作为肿瘤抑制基因，异常启动子甲基化被沉默或降低，可通过氮杂胞苷治疗重新激活，为该基因在致癌过程中的表观遗传机制提供了证据[14那23］．几项研究表明SEPT9作为肿瘤抑制基因，在肝癌发生中其高甲基化过程中对细胞分裂调控起重要作用[15那24］．最近有报道称，血浆mSEPT9作为一种新型的基于循环无细胞dna的表观遗传生物标志物，可以在单个患者水平上诊断HCC，其敏感性为80.8%，特异性为95.8% [16］．在欧洲，肝硬化和HCC的病因主要是C型肝炎和酒精性肝硬化，而在中国，重点主要是b型肝炎。本研究中，血浆mSEPT9在中国人群中的诊断性能[25)进行了研究。结果发现，血浆mSEPT9的诊断性能与之前在欧洲进行的一项研究一致。血浆mSEPT9对HCC具有较高的诊断性能，因此，它可以被认为是诊断健康人和高危疾病患者HCC的一个有前途的生物标志物。

HCC是最常见的原发性肝癌类型，通常由于缺乏有效的诊断生物标志物而被诊断为晚期阶段。血清AFP是最广泛使用的生物标志物，用于诊断HCC。然而，血清AFP水平缺乏足够的敏感性和对HCC早期诊断的特异性，具有近三分之一的早期HCC患者对AFP进行负面的阴性[7.］．因此，AFP不是一个令人满意的早期诊断和预后评估的生物标志物。本研究评估血浆mSEPT9、AFP及其联合诊断的鉴别诊断效能。结果表明，与血清甲胎蛋白相比，血浆mSEPT9或两者的结合显著提高了HCC与健康人之间以及HCC与高危疾病之间的诊断能力。血浆mSEPT9对afp阴性HCC和afp限制HCC患者的诊断具有显著的鉴别性能。此外，肝癌患者血浆mSEPT9的动态变化可用于监测治疗效果。因此，可以想象血浆mSEPT9是一种很有前景的肝癌患者的无创诊断生物标志物。

在以前的一项研究中，血浆mSEPT9检测被证明是一种很好的HCC检测方法[16］．三种PCR反应的施用和用于MSEPT9的特定探针使得检测痕量甲基化的机会最大化SEPT9脱氧核糖核酸。然而，在本研究中，使用生物区进行试剂盒，以将单管PCR进行双管PCR。这减少了测试的数量和污染的机会，降低了测定的成本。这种方法将使患者在未来的筛查中受益。这种简化的MSEPT9测定将测试过程的复杂性从三种PCR反应降低，这可能会使许多患者受益而不降低检测性能。因此，这是一种更简单，更便宜，更有效，方便的HCC筛选方法。

虽然血浆mSEPT9在健康个体和危险疾病患者中显示出良好的HCC检测性能，但它也在结直肠癌中显示出交叉特异性。然而，患有危险疾病的患者，如肝硬化患者，比其他任何类型的癌症更有可能发展为HCC [26］．此外，筛查人群血浆mSEPT9阳性率(4.1%)及大肠癌患病率较低，阳性预测值(PPV)显著降低。因此，在肝脏有危险疾病的患者中，血浆mSEPT9检测呈阳性，最初应引起高度怀疑HCC而非结直肠癌。多中心、大规模队列研究的患者将有助于评估血浆mSEPT9检测在筛查环境中的诊断准确性。

5.结论

这项研究表明，血浆mSEPT9在个体水平上可以作为HCC诊断的非侵袭性和循环表观遗传生物标志物。此外，血浆mSEPT9联合AFP可提高AFP单独诊断HCC的敏感性。

缩写

SEPT9：	Septin9
肝细胞癌:	肝细胞癌
HC:	健康的控制
危险:	非癌性肝病，包括肝硬化和肝炎
乙肝病毒:	乙型肝炎病毒
丙肝病毒:	丙型肝炎病毒
法新社:	α胎蛋白
BCLC:	巴塞罗那诊所肝癌
CT:	循环阈值。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

伦理批准

本研究经首都医科大学附属北京地坛医院伦理委员会批准，所有受试者均获得知情同意。

利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

首都医科大学北京地坛医院青年人才发展基金资助项目(no . 201601)作者没有其他相关的附属机构或财务参与任何组织或实体的财务利益或财务冲突的主题或材料在手稿中讨论，除了那些公开的。我们感谢LetPub (http://www.letpub.com.）在编写本手稿期间的语言援助。

补充材料

图S1:采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验分析血浆SEPT9甲基化(mSEPT9)水平。根据Donald的研究(1)，当两个样本的标准差(SD)不相等时，a测试可能比非参数测试(如Wilcoxon-Mann-Whitney test)有更好的1型误差控制。在这种情况下，这些组的标准差不相等，所以我们显示的结果在文中测试。表S1：甲基化特异性荧光定量PCR分析等离子体SEPT9(mSEPT9)。表S2: SEPT9启动子甲基化与HCC患者临床病理参数的相关性（补充材料）

参考

1. F. Bray，J.Ferlay，I. Soerjomataram，R.L.Siegel，L. A. Torre和A. Jemal，“2018年全球癌症统计数据：185个国家的36个癌症的全球发病率和死亡率估计，”CA:临床医生的癌症杂志，卷。68，没有。6，pp。394-424,2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. 陈伟，孙凯，郑瑞等，“中国癌症发病率和死亡率，2014，”中华癌症研究杂志，第30卷，第2期1, pp. 1 - 12, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. m.c.s. Wong, j.l.w Huang, J. George et al.，“亚太地区肝病流行病学的变化”，自然评论。胃肠病学和肝脏病学，第16卷，第5期。1，页57-73,2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. C. Allemani, T. Matsuda, V. Di Carlo等，“2000-14年癌症生存趋势的全球监测(CONCORD-3):分析来自71个国家322个基于人口的登记的18种癌症中诊断出其中一种的37 513 025名患者的个人记录，”《柳叶刀》第391期10125, pp. 1023-1075, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. a . G. Singal, a . Pillai，和J. Tiro，“肝硬化患者肝癌监测的早期检测、治疗和生存率:一项荟萃分析，”《公共科学图书馆·医学》杂志上，卷。11，不。4，2014年e1001624，2014年。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. M. Omata, a . L. Cheng, N. Kokudo等，“亚太临床实践指南的肝癌管理:2017年更新，”肝脏病学国际，卷。11，不。4，pp。317-370,2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. “监测影像和甲胎蛋白在肝硬化患者肝癌早期检测中的应用:一项荟萃分析，”胃肠病学第154卷第1期6, 1706 - 1718页。e1, 2018年。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. K. Taniguchi, T. Yamada, Y. Sasaki，和K. Kato，“人类多发性肝癌的遗传和表观遗传特征”，BMC癌症，卷。10，不。1，p。530,2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. b.b Baylin，“癌症中的DNA甲基化和基因沉默”，自然临床实践。肿瘤学，卷。2，补充1，pp。S4-11，2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. Y. J. Zhang，H.C.Wu，J. Shen等，“通过检测血清DNA中的异常启动子甲基化，”预测肝细胞癌，“临床癌症研究，卷。13，不。8，pp。2378-2384,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. 郭宏源。h·金，b - k。Oh等，“异常CpG岛高甲基化在发育不良结节和乙肝病毒相关人类多步肝癌早期HCC中的作用”，肝脏病学杂志第54卷第5期5, pp. 939-947, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. N. T. Potter, P. Hurban, M. N. White等人，“基于pcr的实时定性检测人血浆中甲基化SEPT9 DNA的验证，”临床化学，第60卷，第2期9, pp. 1183-1191, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. C. Robertson, S. W. Church, H. A. Nagar, J. Price, P. A. Hall, and S. E. H. Russell，“SEPT9异构体的性质和对GTP结合的要求”，病理学杂志，卷。203，没有。1，pp。519-527，2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. J. F. Burrows, S. Chanduloy, M. A. McIlhatton等人，“卵巢肿瘤中septin基因SEPT9的表达改变”，病理学杂志，卷。201，不。4，pp。581-588,2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. A. Villanueva, A. Portela, S. Sayols等，“DNA甲基化在肝癌中的预后和表皮因子”，肝脏病学，卷。61，没有。6，pp。1945-1956,2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. A. Oussalah, S. Rischer, m . Bensenane等，“血浆m _SEPT9_:诊断肝癌的一种新型无循环细胞dna表观遗传生物标志物”，eBiomedicine.， vol. 30, pp. 138-147, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. D. Wu, G. Zhou, P. Jin等，“使用简化的sept9_基因甲基化检测大肠癌是一种可靠的机会筛查方法”，分子诊断杂志第18卷第2期4, pp. 535-545, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. 李勇等，“SEPT9基因甲基化检测在机会筛选中检测结直肠腺瘤的能力”，表观组织，第9卷，第5期。5，页599 - 610,2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. L.宋，H. yu，J.Jia和Y. Li，“系统审查了9月9种基因甲基化测定在结肠直肠癌筛查，监测，诊断和预后的性能的系统审查，”癌症生物标志物第18卷第2期4, pp. 425-432, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. C. Zhang, W. Yu, L. Wang等，“支气管肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因的DNA甲基化分析用于肺癌诊断”，癌症杂志》，第8卷，第2期17, pp. 3585-3591, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. K. Woodson, K. J. O 'Reilly, J. C. Hanson, D. Nelson, E. L. Walk，和J. a . Tangrea，“尿液中检测GSTP1甲基化作为诊断前列腺癌的生物标志物的有用性，”泌尿外科杂志第179期2，页508-512,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. P. A. Hall和S. E. H. Russell，《septin基因家族的病理生物学》病理学杂志第204卷第1期4，页489 - 504,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. R. Grützmann, B. Molnar, C. Pilarsky等，“septin 9 DNA甲基化检测外周血大肠癌的敏感性”，《公共科学图书馆•综合》，第3卷，第2期。第11条e3759条，2008年。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. A. Kakehashi, N. Ishii, T. Shibata等，“线粒体抑制素和septin 9在大鼠肝癌发生的发病中有牵连”毒物学的科学，卷。119，没有。1，pp。61-72，2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. Liu Z.， Jiang Y.， Yuan H.，“特定病因引起的原发性肝癌的发病率趋势:来自2016年全球疾病负担研究的结果及其对肝癌预防的影响”，肝脏病学杂志，第70卷，第2期4，第674-683页，2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. H. T. Sørensen, S. Friis, J. H. Olsen等，“肝硬化患者肝癌和其他类型癌症的风险:丹麦全国队列研究，”肝脏病学第28卷第2期4, 1998年。视图:出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2020李宝良等。这是一篇发布在创意公共归因许可证，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。