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丁源，孙忠权，张思同，周六志，徐倩慧，周东凯，李艳杰，韩鑫，徐浩，白杨，徐昌，丁浩，葛瑶，王伟林， ＂Snorna SnORA71A作为一种新型生物标志物在肝细胞癌预后"，疾病标记， 卷。2020， 文章的ID8879944， 7 页面， 2020． https://doi.org/10.1155/2020/8879944
Snorna SnORA71A作为一种新型生物标志物在肝细胞癌预后
元鼎，1，2，3.，4，5 Zhongquan太阳，1，2，3.，4，5 Sitong张，1，2，3.，4，5 刘志洲
，1，2，3.，4，5
Qianhui徐，1，2，3.，4，5
东凯周，1，2，3.，4，5
李艳，1，2，3.，4，5
鑫汉，1，2，3.，4，5
郝徐，1，2，3.，4，5
杨呗，1，2，3.，4，5
常旭，1，2，3.，4，5
郝叮1，2，3.，4，5et al。
姚通用电气，2，3.，4，5
威林王1，2，3.，4，5
1浙江大学医学院第二附属医院肝胆碱和胰腺外科杭州310009
2浙江省肝胆碱肿瘤精度诊断与治疗重点实验室，杭州310009
3.浙江省肝癌诊疗技术研究中心，浙江杭州310009
4浙江大学肝胆胰疾病精准诊疗临床医学创新中心，浙江杭州310009
5浙江省肝胆胰疾病临床研究中心，浙江杭州310009
抽象的
背景．小核仁rna (Small nucleolar RNAs, snoRNAs)已被证明在各种细胞生理过程中发挥重要作用。近年来，研究发现snoRNA的失调与多种恶性肿瘤的发生有关。然而，SNORA71A在肝细胞癌(HCC)中的新作用仍不清楚。在本研究中，我们旨在探讨SNORA71A在HCC中的表达及其潜在意义。方法．采用实时荧光定量PCR检测细胞系和临床标本中SNORA71A的表达。将所有入组的HCC患者分为SNORA71A低表达亚组和高表达亚组，采用各自的统计学分析方法对其临床特征和生存结局进行比较。结果．SK-HEP-1中的SnORA71A显着下降（ )，Huh-7 ( )，Hep3B ( )，及临床HCC标本( )．比较SNORA71A表达亚组的临床特征，发现低SNORA71A表达与肿瘤直径大、病变多发、包膜侵犯、肿瘤分化差、TNM分期显著相关( )．此外，研究发现，SNORA71A表达较低的HCC患者术后肿瘤复发的风险更高(中位时间:9.5个月vs. 35.2个月;低和高; ）差的整体生存率差（中位数：36.8与52.9个月;低与高; )．此外，SNORA71A的表达是无肿瘤( ；95%可信区间(0.263 - -0.770); ）长期存活率( ；95％CI [0.127-0.657]; )．结论．我们的研究首次表明，下调SNORA71A可作为HCC患者临床评估和预后预测的新的生物标志物。
1.介绍
肝细胞癌（HCC）是第五次常见的癌症，导致世界上第四次与癌症相关的死亡人数有关[1］．肝细胞癌发生的危险因素有一系列，主要包括慢性肝炎病毒感染、脂肪性糖尿病、过度饮酒、非酒精性脂肪肝[2］．尽管肝细胞癌的治疗在肝切除和化疗方面取得了很大的成就，但HCC患者的生存结局仍因其复发、转移和死亡率高而不令人满意[3.］．血清甲胎蛋白监测作为HCC诊断最常见、最重要的手段，不足以有效预测HCC患者术后生存[4］．因此，寻找一种新的可靠的肝细胞癌预后的临床标志物是至关重要的。
小核仁RNA（Snorna）是在真核细胞的核仁中广泛发现的一种非分量RNA [5］．它的长度为0-300nt，并具有保守的结构元素。虽然这些翼伞曾经考虑过单一函数和在rRNA预处理中的有限效果，但最近的积累证据表明，一些Snornas还参与了各种细胞生理过程，包括细胞增殖，分化，表观遗传，调节。并证明了Snorna的一些失去抑制作为各种癌症中的肿瘤抑制基因或癌基因[6- - - - - -9］．Han等人的综述明确指出，SNHG1、SNHG6、SNHG15、SNHG16、SNHG20通过不同的调控机制在HCC中发挥不同的作用。这些SNHGs可以促进和抑制肿瘤发生[10.］．例如，snoRNA SNHG1通过miR-137的负调控促进结直肠癌的发生和进展[11.］．此外，snoRNA SNORA18在肝细胞癌中起抑癌基因的作用[12.］．
由克隆的snoRNA宿主基因17 (SNHG17)的第三内含子编码的SNORA71A，通常引导18S rRNA中U406的假尿苷[13.］．近来，越来越多的研究报告说，在各种类型的癌症中，SnORA71a在各种类型的癌症中进行了疑虑[14.]及乳腺癌[15.]，并在肿瘤进展中发挥重要作用。然而，SNORA71A在肝癌中的新作用和潜在机制仍不清楚。在本研究中，我们旨在确定SNORA71A在HCC中的表达特征及其潜在的临床意义。
2.材料和方法
2.1。患者和组织样品
为减少潜在的混杂因素，所有入组患者术前均未接受任何放疗、化疗或内分泌治疗。所有入组患者均经组织病理学检查诊断为HCC。所有参与研究的患者均获得书面知情同意和批准。本研究经浙江大学附属第一医院(中国杭州)机构伦理委员会批准。
HCC组织和相邻的肝组织于2013年1月至2014年1月至2014年12月之间接受肝切除的连续HCC患者.HCC组织标本由TNM阶段的病理学家进行2例病理检查。将组织立即冷冻液氮术后，然后在-80℃下储存以进行RNA分离。从医院电子系统数据库收集患者数据，包括个体信息，肝功能指标，α胎儿蛋白值，HBV感染，病变特征，病理分化和TNM分类。
2．2．无瘤和长期生存的随访
肝切除术后，所有患者均均持续5年。初始手术后，无肿瘤生存的时间终端包括HCC，HCC远处转移或死亡的任何原因，没有癌症相关的事件，而在死亡或最后一次随访时间计算长期存活率5年。家庭成员确定患者的死亡，以及公立医院记录的审查。收集所有已注册患者数据的所有后续数据的员工都对参与者的身份视而不见。
2．3．细胞培养
从实验室中获得的人常规肝细胞系（QSG-7701）和HCC细胞系（SK-HEP-1，HUH-7和HEP3B），在DMEM培养基（BI，以色列）中，具有10％FBS（BI，以色列）在37°C的潮湿培养箱（Thermo Fisher，USA）中，以色列和100毫/ ml青霉素和100mg / ml链霉素（Sangon，China）含有5％Co2．
2．4．RNA提取与实时荧光定量PCR
根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen，USA）提取来自细胞系和组织标本的总RNA。使用cDNA逆转录试剂盒（南京，中国）反转转录到cDNA中的RNA。为了确定SnORA71a的表达水平，用定量实时聚合酶链反应（RTCHE，Basel，瑞士）测试cDNA样品。所有样品一式三份测试。使用甘氨醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达作为内源性对照，通过对比CT法公式计算SnOra71a的相对表达 ．所有PCR引物的序列如下(5 -3. )：GAPDH：Caggaggcattgctgatgatgat（前进），GaAGGCTGGGCTCATTT（反向）;SnORA71A：AGGTCattgatagTgcagggag（前进），GGTTCGGATGGGATAGGGG（反向）。
2．5．统计分析
所有的统计分析都使用SPSS (statistical Package for the Social Sciences) 19.0 (SPSS, Chicago, IL)进行。两组之间的差异用学生的 -测试。采用卡方检验，检测SNORA71A表达与不同临床特征的相关性。采用Kaplan-Meier生存图和log-rank检验评估不同亚组无瘤生存率和长期生存率的差异。首先对HCC预后与临床参数的关系进行单因素分析，然后逐步对这些显著差异因素进行多因素logistic回归分析。所有数据用 (SD)和 被认为具有统计学意义的差异。
3.结果
3．1．SNORA71A在HCC中的表达水平
为确定SNORA71A在HCC中是否有差异表达，首先利用人正常肝细胞(QSG-7701)和HCC细胞株(SK-HEP-1、Huh-7、Hep3B)通过定量RT-PCR分析SNORA71A的表达。如图所示1， SK-HEP-1中SNORA71A的表达( )，Huh-7 ( )，和Hep3B ( ）显着低于QSG-7701。然后，如图所示2，在临床组织检测中也发现了类似的结果，与相邻肝组织相比，HCC组织中SNORA71A的表达多为低表达( )．因此，这些结果提示SNORA71A可能在HCC中起抑瘤作用。
（一种）
（b）
3.2。SnORA71A表达与HCC患者临床病理特征的关系
根据SNORA71A的个体表达情况，将132例HCC患者分为高表达组和低表达组。统计学分析SNORA71A表达与HCC患者临床病理特征的关系。在表1，低SNORA71A表达与大肿瘤直径显著相关( )，多个病变( )，荚膜入侵( )，肿瘤不良分化（ )，和TNM阶段( )．然而，SNORA71A表达与其他临床病理特征如乙型肝炎、AFP或肝硬化之间没有统计学意义。
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AFP = α胎蛋白;TNM = tumor-node-metastasis;
；值是或者（％）。 |
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３．３．下调SNORA71A预示HCC患者预后不良
为了确定SnORA71A表达是否可以作为一种新型生物标志物预测HCC患者的预后，使用Kaplan-Meier方法比较两种苯二甲二角31表达亚组的无肿瘤和长期存活数据。根据数字的结果3.和4，我们发现HCC患者具有高SnORA71a表达的患者倾向于在肝切除术后肿瘤复发率较低，较好的总存活条件。在不同的SnORA71a表达水平的亚组之间，中位肿瘤生存时间（9.5与35.2个月;低与高;P<0.001)和中位长期生存时间(36.8 vs. 52.9个月;低和高;P<0.001)差异有统计学意义。
3．4．鉴定肝癌预后的独立预后因素
为确定肝癌患者生存的独立危险因素，采用单因素和多因素Cox回归分析各种临床病理因素和SNORA71A表达。在表中2和3.SnORA71a表达被证明独立地与无肿瘤（HR [95％CI]：0.450 [0.263-0.770]）。 ）以及长期生存率(HR [95% CI]: 0.289 [0.127-0.657]; ）HCC患者。这些结果支持SnORA71A表达能够作为HCC患者预后评估的生物标志物。
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AFP = α胎蛋白;TNM = tumor-node-metastasis;HR =危险比;被认为具有统计学意义。 |
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AFP = α胎蛋白;TNM = tumor-node-metastasis;HR =危险比;被认为具有统计学意义。 |
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4.讨论
肝细胞癌是最常见的肝癌和实体肿瘤，进展快，预后差[16.］．由于HCC通常表现为体内隐匿性进展，多例HCC患者在中晚期被诊断[17.］．虽然肿瘤直径、TNM分期、AFP等临床特征已被列为预测HCC患者预后的标准，但由于敏感性和特异性不理想，这些分类方案仍局限于成为HCC患者常用的预测指标[18.］．然而，在过去的40年中，AFP已被用于监测HCC，但敏感性差和特异性差：39％至65％和76％至94％[19.，20.］．此外，Zhang和Yang的研究表明，当HCC肿瘤肿块直径小于2cm时，AFP水平很少升高[21］．因此，在HCC患者中探索一种新的生物标志物是非常重要和必要的。
小核仁RNA (small nucleolar RNA, snoRNA)作为一种非编码RNA，最初被发现具有调节rRNA假尿苷的功能[22］．如今，新兴的证据表明，Snorna也在各种癌症的肿瘤内发挥着重要的调节作用，包括肝癌和乳腺癌[23- - - - - -25］．其中，Cui等人指出，snoRNA上调SNORA23通过调节包含频谱重复的核膜促进小鼠异种移植瘤的侵袭和转移2 [26］．Baral等人。据报道，Snord126，Snord78，ACA11，SnORA47和Snord76也可以作为与临床特征相关的重要预后标志物。Snorna的异常表达促进细胞增殖并导致肝癌的发育[27］．此外，Cao的团队首次报道了Snorna SnOra18L5的失调可能会增加HBV相关肝细胞癌的风险，用于核糖体RNA成熟异常[28］．此外，在HCC中，还发现Snorna Snord113-1被显着下调并用作肿瘤抑制作用[23］．SNHG16、SNORD76、SnoU2_19可通过Wnt/调控肝癌的发生发展β-连环蛋白信号通路[29］．因此，这表明一些特定的snoRNAs具有潜在的能力，可作为HCC患者临床评价的生物标志物。
在我们的研究中，我们首次分析了HCC细胞系和组织中SnORA71a的表达水平，并阐明了SNORA71A在HCC中普遍下调。此外，总共132名患者的分析证明，SnORA71A表达与肿瘤直径，多重病变，囊状侵袭，分化和TNM阶段相关。我们的结果表明，SnORA71A表达是肿瘤生存期和HCC患者的长期存活的独立危险因素。
总之，我们的研究首次证明了SNORA71A可以作为HCC患者预后和治疗监测的一种新的生物标志物。未来还需要更多的研究来探索具体的机制，验证我们的发现。
缩写
| 肝细胞癌: | 肝细胞癌 |
| snoRNA: | 小核仁的RNA |
| 法新社: | 胎儿蛋白α |
| TNM： | Tumor-node-metastasis |
| 人力资源: | 风险比。 |
数据可用性
在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。
伦理批准
这项回顾性研究是根据1975年赫尔辛基宣言的道德准则进行的。所有参与者均已签署书面知情同意书。获得浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会伦理批准。
的利益冲突
作者报告在这项工作中没有利益冲突。
作者的贡献
W.W.和Y.D.构思和设计了这项研究。Y.D.，Z.S.，S.Z.，L.Z.和Q.X.进行这项研究。D.Z.，H.X.，Y.B.和H.D.促成了收购数据。Z.S.，S.Z.，C.X.和Y.G.分析了数据。W.W.，Y.D.，Z.S.和S.Z. interpreted the data. W.W., Y.D., Z.S., S.Z., and L.Z. reviewed and edited the manuscript. All authors read and approved the manuscript. Yuan Ding, Zhongquan Sun, and Sitong Zhang contributed equally to this paper.
致谢
国家自然科学基金项目(No. 81572307, No. 81773096);浙江省医疗卫生技术发展重大计划项目(No. 7211902);浙江省重点研发计划项目(No. 2018C03085);基金资助:浙江省公益技术研究项目(No. 513513516);基金资助:国家自然科学基金资助项目(LGD19C040006);Y201840044)。
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