乙酸乙酯馏分Hedyotis diffusa+黄芩barbata通过OPN-FAK / ERK / NF抑制骨转移乳腺癌细胞的迁移κ..B轴

抽象的

Hedyotis diffusa+黄芩barbata是一种常用于治疗炎症相关疾病和各种类型的肿瘤的药用的对联。然而，该对联对对联对肿瘤细胞迁移的影响尚未阐明。借助MCF-7-BOM，ER +乳腺癌MCF-7的骨转移宿盲，我们表明乙酸乙酯馏分以相等的重量比提取Hedyotis diffusa+黄芩barbata(EA11)以浓度依赖性的方式抑制MCF-7-BOM的细胞迁移。为了明确其潜在的分子机制，我们发现EA11降低了骨桥蛋白(OPN)的表达，并干扰了FAK/ERK/NF-κ..B信号通路，对乳腺癌骨转移至关重要。该研究强烈建议EA11可以代表潜在的治疗剂免受乳腺癌骨转移的潜在治疗剂。

1.介绍

转移是全世界乳腺癌患者生存的严重威胁[1那2[骨转移发生在大约65％的晚期乳腺癌患者中。骨转移患者患有骨痛，病理骨折，高钙血症和脊髓压缩，而五年的存活率约为20％[3.那4.］．传统的骨转移治疗方法包括放疗、化疗、靶向治疗、内分泌治疗和骨调节药物治疗。然而，目前可用的干预措施的有效性有限[5.］．

作为分泌的二醇磷蛋白和由基因SPP1编码的骨桥蛋白（OPN）参与骨质重塑中的骨基质矿化和重吸收过程。在各种肿瘤中检测到OPN的异常表达（乳腺癌，前列腺癌，肺癌，胃癌和黑色素瘤），并且与乳腺癌的开始，转移和预后密切相关[6.那7.］．实验证据还支持OPN在乳腺癌骨转移中的作用。在最近的研究中，局灶性粘附激酶（FAK）途径的激活被报告为OPN诱导的细胞迁移的必然事件[8.］．也发现opn通过其结合激活ERK1 / 2α.V.β3整合在[9.，这反过来又促进了乳腺癌的进展。此外，OPN已被证明通过NF-增强癌细胞的侵袭性κ..B介导的信号机制[10］．这些发现表明，靶向OPN相关的信号传导途径可能是患乳腺癌骨转移的潜在治疗策略[11那12］．

中药（TCM）已被广泛用作中国恶性肿瘤的必要佐剂治疗。Hedyotis diffusa，茜草科家族的植物，含有黄酮类，多糖，三萜类化合物，甾醇和三萜类化合物。许多食材Hedyotis diffusa具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性。Hedyotis diffusa通常用于治疗乳腺癌、结肠癌、肝癌和肺癌[13-15］．黄芩barbata属于唇形科，具有抗肿瘤活性。同样的,黄芩barbata也常用于治疗各种肿瘤[16那17］．特别是,Hedyotis diffusa+黄芩barbata常作为对联药用于治疗各种炎症相关疾病和癌症[18那19］．

我们之前报道EA11具有有效的抗炎活动[20.］．由于慢性炎症是癌症的标志之一，我们研究了EA11对MCF-7-BOM细胞迁移的影响，进一步探索了相关的分子机制。

2。材料和方法

２.１.试剂和化学物质

Hedyotis diffusa和黄芩barbata购自上海洋河塘药业有限公司(中国上海张江高科技园区)，并经上海食品药品监督管理局(SIFDC)确认。MCF-7-BOM由美国密西西比大学Dr. Yu-dong Zhou提供。Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) medium dry powder、胎牛血清和0.25% trypsin从Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)中获得。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO, USA)。所用抗体的来源有Proteintech(芝加哥，IL，美国)的抗opn抗体(22952-1-AP)， Bioworld Technology (St. Paul, MN, USA)的anti-p-FAK (BS4718)，以及anti-FAK (#3285)， anti-NF-κ..B（＃3033），抗P-NF-κ..B (#8242)， anti-ERK1/2(#9102)和anti-p- ERK1/2(#9101)来自Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA)。

２.２.EA11主要成分的制备与鉴定

EA11是制备的，如前所述，并进一步表征HPLC [20.］．

２.３.细胞培养

在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养MCF-7-BOM细胞，并在37℃下孵育5％CO₂培养箱(Thermo, Waltham, MA, USA)。细胞每2-3天传代一次。

2.4。细胞活力测定

MCF-7-BOM细胞以2 × 10的密度接种于96孔板中^3.每孔细胞过夜。然后用EA11(0, 12.5, 25, 50, 100和200)处理细胞μ.g/ml)或0.25% DMSO(对照剂)处理72 h后，加入20μ.L含量为5mg / ml mTT溶液。孵育4小时后，除去孔中的培养上清液，100 μ.加入L的DMSO溶液完全溶解晶体。490nm处的光学密度值由板式读取器（Molecular Devices，Ca，USA）测量。

2.5。伤口愈合测定

将MCF-7-BOM细胞以6×10的密度接种在6孔板中^5.每孔细胞过夜。用无菌吸管头产生划痕，然后冲洗几次以清除脱落的细胞。然后细胞在含有0、25和50的完全培养基中培养μ.G / ml EA11并在0,24和48小时下拍摄的光学显微镜（100x）（奥林巴斯，东京，日本）。通过监测间隙的大小来确定细胞迁移。

2.6。Transwell迁移测定

用或没有EA11处理24小时处理的MCF-7-BOM细胞被覆盖到上室（8 μ.米孔隙大小;康宁康复，我，美国）在5×10^4.每孔600个细胞μ.将无血清培养基加入下腔室中。在24小时细胞迁移后，用棉拭子除去上腔室中的细胞，并用0.5％晶体紫定固定腔室下表面上的细胞。在光学显微镜（200×）下拍摄照片，通过计数染色细胞定量细胞迁移。

2.7。入侵分析

为了评估MCF-7-BOM细胞的侵袭，首先用EA11处理细胞24小时，然后加入Matrigel涂覆的Transwell板的上腔室（8 μ.米孔隙大小;美国康宁公司)的密度为2 × 10^5.每孔600个细胞μ.L中加入下室中的L培养基。在22小时侵袭期后，用棉拭子除去剩余在上室中的细胞，而上腔间下表面上的细胞用0.5％晶体紫色染色。通过在光学显微镜（200×）下染色细胞计数染色细胞来测量体外侵入。

2.8。免疫印迹分析

使用含蛋白酶的细胞裂解物（Beyotime技术，江苏，中国）洗涤细胞并在冰上裂解并裂解。每个样品的蛋白质浓度由BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测定。蛋白质样品（30 μ.g/lane)在10% SDS-PAGE上分离，转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶阻断后，用各自的抗体对膜进行印迹，并使用ECL Western Blotting检测试剂(Millipore, Bedford, MA, USA)在Tanon成像系统(Tanon, Shanghai, China)上进行可视化。

2.9。统计分析

采用SPSS 20.0版本的方差分析进行统计分析，所有实验至少重复三个独立实验。结果以均数±标准差表示。的价值被认为是显着的。

结果

３.１.EA11对MCF-7-BOM细胞生长的影响

为了确定EA11对MCF-7-BOM细胞生长的影响，用不同浓度的EA11处理细胞72小时，然后MTT测定测量细胞生长。通过与未经处理的细胞进行比较，我们观察到EA11在100 μ.G / ml显着抑制MCF-7-BOM细胞的生长（ ）（数字1），表明EA11浓度<100 μ.g / ml很少细胞毒性。

3.2。EA11抑制MCF-7-BOM细胞迁移和侵袭体外侵袭

作为浓度<100的EA11 μ.g/ml的细胞毒性很小，我们研究了浓度为25和50的EA11对细胞迁移的影响μ.克/毫升。创伤愈合和Transwell试验均表明，EA11以剂量和时间依赖性的方式阻止MCF-7-BOM细胞的迁移( ）（数字2）。在一个平行的实验中，我们通过Matrigel侵袭室检查了EA11对MCF-7-BOM细胞的侵袭性的影响。虽然MCF-7-BOM细胞容易被侵入Matrigel，但EA11以浓度依赖的方式阻断了这些细胞的体外侵袭（ ）（数字3.）。

3.3。EA11下调MCF-7-BOM细胞中OPN的表达

据报道，OPN参与乳腺肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并与骨肿瘤微环境相关[21］．为了确定细胞迁移和侵入中的EA11-LED抑制是否在功能上与OPN相关联，我们分析了EA11对MCF-7-BOM细胞中OPN表达的影响。同样，对于我们用细胞迁移/侵袭观察到的，Western印迹显示EA11剂量依赖地降低了MCF-7-BOM中的opn的丰度（ ）（数字4.）。

3．4．EA11干扰FAK/ERK/NF-κ..B MCF-7-BOM细胞中的信令途径

OPN与整合素的结合已被证明可调节乳腺癌细胞的迁移和侵袭，而局部粘附激酶(FAK)信号通路的激活对OPN调节细胞迁移/侵袭至关重要[8.］．ERK / MAPK信令路径在FAK下游功能以促进细胞迁移，而据报道，opn的增强水平与升高的NF-相关κ..B乳腺和肝脏肿瘤的活性[10］．为了研究ea诱导的OPN表达减少和这些信号通路之间的潜在联系，我们用浓度为0、25和50的EA11处理MCF-7-BOM细胞μ.G / ml，然后是蛋白质印迹检测磷光体 - FAK，磷光体 - ERK和磷光体 - NF-κ..B. FAK, ERK和NF-的磷酸化κ..B在MCF-7-BOM细胞中可见。相反，EA11降低了FAK、ERK和NF-的磷酸化水平κ..B（ ）（数字5.），暗示FAK / ERK / NF的干扰κ..EA11介导的B信号很可能与EA11介导的OPN表达抑制和细胞迁移/侵袭有关。

4。讨论

晚期乳腺癌常伴有肺、肝、脑和骨的临床转移[22］．在骨转移期间，乳腺癌细胞必须经历侵袭转移级联以将自己转化为转移细胞[23那24］．在到达骨头位点后，癌细胞通常浓缩在内皮内，然后在骨微环境中破裂成骨细胞和骨细胞之间的微妙平衡。这种平衡的扭曲破坏了正常的骨质重塑和完整性，最终导致骨破坏[25那26］．在分子水平上，骨保护素(OPG)-RANKL比值异常引发溶骨转移的恶性循环[27那28］．

乳腺癌和前列腺癌患者的蛋白质表达水平增加，预后差和存活缩短。已经显示下调OPN表​​达来阻止乳腺癌的进展和转移，表明OPN作为肿瘤进展和转移的重要介质。OPN对骨骼显示特定亲和力的事实进一步突出了其在骨转移中的重要性[7.那29那30.］．在本研究中，我们发现EA11显著降低了MCF-7-BOM细胞中OPN的表达，并极大地抑制了细胞迁移和体外侵袭。

nf-κ..B激活对于各种整合素信号传导和肿瘤转移至关重要[10］．nf-κ..已显示B抑制剂抑制OPN诱导的细胞迁移[9.］．其中一个例子是用NF-处理A549细胞κ..B抑制剂（PDTC）或IKappab蛋白酶抑制剂（TPCK）阻断OPN诱导的肺癌细胞迁移[31］．最近的研究还表明，OPN可以增加A549细胞中磷光体-FAK，AKT和ERK的水平，表明它们可能是OPN-LED细胞迁移的介质。由于OPN刺激的ERK磷酸化由FAK突变体减少，而FAK和ERK2突变体可以减少OPN诱导的NF-κ..B激活，这些研究的结果表明，由FAK，ERK和NF-组成的信号轴κ..B调节OPN对细胞迁移和侵袭的调节[9.］．我们观察到EA11抑制乳腺癌细胞迁移/侵袭并干扰FAK / ERK / NF-的激活κ..B信号通路表明EA11可以是抗乳腺癌细胞骨转移的活性剂。

5.结论

我们的结果表明，EA11抑制MCF-7-BOM细胞的迁移。ea11诱导的细胞迁移抑制很可能与抑制OPN表达和FAK/ERK/NF-失活有关κ..B信令途径。该研究表明EA11可以作为治疗乳腺癌骨转移的潜在治疗剂。

数据可用性

用于支持本研究发现的原始数据可由通讯作者要求提供。

利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

作者的贡献

方廷、晏颖萱、杨乐乐对这部作品的贡献是相同的。

致谢

国家自然科学基金项目(no . 81773946, no . 81573673, no . 81001666);上海中医药大学本科生创新项目(no . 201810268036)。关键词:边坡，边坡稳定性，边坡稳定性

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