涉及胰腺癌肿瘤发展的微环境元素

抽象

介绍。尽管多年来，尽管有密集的研究，胰腺癌仍然是最致命的癌症之一。手术干预仍然是治疗的主要可能性，因为化疗和放射治疗对长期存活的影响最小。我们仍在寻找这种破坏性疾病的薄弱程度。材料和方法。从36例患者收集胰腺肿瘤组织样品。免疫组织化学染色用于评估生长因子和免疫渗透的表达。通过Gelatin酶谱评估MMP2和MMP9的活性，在7.5％SDS-PAGE凝胶中评估了0.1％明胶。结果。所有生长因子都在胰腺肿瘤组织中强烈表达。我们发现G3肿瘤的C-Met受体表达水平高于G2肿瘤。此外，我们发现活性MMP2在肿瘤的所有阶段存在，而活性MMP9在更先进的肿瘤中。丰富的免疫细胞浸润对于肿瘤组织具有鲜明，尤其是巨噬细胞浸润肿瘤组织。我们发现巨噬细胞量与淋巴结转移相关。结论。在我们的研究中，我们证明了影响肿瘤微环境C-MET受体的许多因素，浸润巨噬细胞和MMP2对胰腺癌的发育和侵袭具有显着影响。

背景

尽管多年来，尽管有密集的研究，胰腺癌仍然是最致命的癌症之一。手术干预仍然是治疗的主要可能性，因为化疗和放射治疗对长期存活的影响最小。在过去的二十年中的研究产生了很多对胰腺癌生物学的洞察力，但它既没有改善的诊断方法也没有治疗方式。我们仍在寻找这种破坏性疾病的薄弱程度。

近年来，肿瘤微环境在肿瘤进展中发挥着关键作用[1]。在胰腺中，这种微环境特别异质。它由具有癌细胞，星状细胞，渗透炎症细胞的致密纤维化基质和胰腺的遗骸组成。这些细胞是各种生长因子的来源以及常规因子。存在于肿瘤组织中的成纤维细胞负责生产胶原和纤连蛋白，其增加肿瘤的化学化。由于纤维化组织丰富，肿瘤环境强烈缺氧[2那3.]。所有这些因素都有助于疾病的侵略性自然和早期转移的发生。

渗透炎性细胞是影响肿瘤生长，侵袭和转移的丰富因素来源。巨噬细胞特别感兴趣。近年来研究了他们在肿瘤环境中的作用[4.]。众所周知，它们是刺激eGF，PDGF-BB，HGF等细胞增殖的生长因子的源泉α.和tgf.。此外，它们还产生基质金属蛋白酶-9（MMP9），其参与各种必要过程[5.]。

基质金属蛋白酶是一组20个蛋白酶分为4个亚类：胶原酶，明胶酶，基质序和膜型MMP。他们参与细胞外基质的改性，这使得这些过程的重要组成部分是血管生成，细胞迁移和转移形成。他们还参与了许多蛋白质的激活，并以这种方式调节增殖和细胞凋亡[6.]。

MMP 2和9被分类为明胶酶。它们在转移形成中的作用是显着的，因为它们的基材是胶原蛋白IV，是基底膜的组分。其降解使得可以迁移癌细胞。在许多类型的癌症中陈述了MMP 2和9的表达增加。在乳腺癌中[7.它们的活性与远处转移相关，并且在食管癌的情况下随着侵袭性的增加[8.]。

同样在胰腺癌中，显示了MMP的强烈表达。在对6个细胞系进行的研究中，显示MMP2的增加表达和活性与胰腺癌细胞的更大的侵入性潜力相关[9.]。

我们的研究目的是调查可能对肿瘤发育产生影响的三点：生长因子的表达，炎症细胞浸润和基质金属蛋白酶的酶促活性，以便具有更完整的胰腺癌肿瘤图像。

2.材料和方法

2.1。患者和标本系列

从36例胰腺癌接受手术切除的患者收集胰腺肿瘤组织样品。基于华沙医科大学生物伦理委员会批准的议定书收集组织。根据TNM分期和肿瘤等级分类肿瘤。PDAC患者在T1-T4（T1）之间进行范围（），t2（），t3（）和t4（）），n0（），n1（），m0（）和m1（）阶段。还评估了组织学等分学等级：G1（），G2（）和g3（）。

对于蛋白质分离，将样品冷冻并在-20℃下储存直至它们使用。用于免疫组织化学分析的样品 mm were frozen for 45 seconds in acetone using dry ice at a temperature of −70°C and stored at −80°C.

2.2。凝胶酶谱系

使用总蛋白质提取试剂盒（Millipore，Billerica，USA）从肿瘤组织中分离蛋白质。10. μ.从组织中分离的总蛋白质用2份Zymogram样品缓冲液（Bio-rad Laboratories，Hercules，USA）稀释，并通过含有0.1％明胶（Sigma-Aldrich，St.Louis，美国）的7.5％SDS-PAGE解决。电泳后，用2.5％Triton X-100洗涤凝胶，以将SDS除去两次30分钟，并在显影缓冲液中孵育（50mM pH 7.5 Tris缓冲液，其中5mM CaCl₂和0.2M NaCl）在37℃下为20小时。通过用0.5％COMASSIE蓝染色的凝胶来可视化明胶酶活性，然后在脱水溶液中孵育（甲醇40％，乙酸10％）。之后，饮料凝胶用水冲洗。对于半定量评估，采用了凝胶的照片，并使用了Microimage（Olympus，Japan）软件。

2.3。免疫组织化学

来自胰腺癌的冷冻组织是哭泣的5 μ.M部分。将每个组织用苏木精 - 曙红（H＆E）染色。Dako Real Envision检测系统，过氧化物酶/ DAB +，兔/小鼠用于免疫抑制。在室温下干燥后，将载玻片用丙酮固定10分钟。然后将它们孵育5分钟的双内源酶块（Dako，Glostrup，Denmark）。将这些部分与适当的抗体一起孵育25分钟，用于EGF（Z-19），EGFR（EGF-R2），PDGF-BB（N-30），HGFα.（H-145）和C-MET（C-12）（全部表达Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，USA）和CD68和CD3（EBM11; F7.2.38，Dako，Glostrup，Denmark）。然后与Dako Real Envision / HRP孵育，兔/小鼠（ENV）在室温下25分钟，然后使用Dako Real Dab +色原的颜色反应3分钟。幻灯片用Mayer的苏木精定位。

2.4。免疫组织化学染色的半定量分析

为了定量评估，在低功率40x下扫描肿瘤切片后选择5个区域。使用Microimage Software（奥林巴斯，日本）以200倍放大率分析这些字段，计算总染色区域。

2.5。统计分析

进行了比较：两组与Mann-Whitney用Kruskal-Wallis测试测试和三组。最小的意义程度被定义为。

结果

3.1。胰腺癌生长因子

将25种肿瘤组织免疫组织化学，用于表达肿瘤组织中的生长因子（图1）。在所有情况下发现生长因子的表达。EGF的免疫反应性在癌细胞的细胞质中较弱至中度。至于EGFR，我们发现其表达在癌细胞的细胞质中适度至强烈，在小导管细胞中弱。PDGF-BB免疫反应性在癌细胞的细胞质中适度至强度，并且在6例中，我们发现癌细胞中的核染色以及渗透免疫细胞。HGF的膜质和细胞质染色α.在肿瘤细胞中强烈，而C-Met的染色是中等的。

将生长因子的表达与肿瘤分级和N阶段进行比较。使用全部考虑的生长因子表达的半定量估计，统计分析的结果表明，在C-MET受体的情况下，G2和G3组的表达的唯一差异在统计学上相关（）（图2）。

3.2。渗透炎症细胞

为了评估细胞浸润，我们使用针对CD68，HLA II，中性粒细胞弹性蛋白酶，CD3和CD56的单克隆抗体。我们发现众多淋巴细胞和巨噬细胞渗透。也存在嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的强烈表达。观察到NK细胞渗透。肿瘤腺体周围存在炎症细胞，并且在癌细胞浸润的神经中也强烈地存在（图3.）。

我们与N阶段进行了比较结果，我们发现，肿瘤组织中的巨噬细胞数量在淋巴结转移（401）中显着高于N0组（167）（）（图4.）。

3.3。凝胶酶谱系

在来自胰腺肿瘤的30个组织分离物中研究了Genolytic活性。活性MMP2（62kDA）存在于88％的88％和MMP9（83kDA）中，38％案例。对于6个样本，由于凝胶的模糊图像，我们无法确定MMP的活动。

根据组织学交易的结果，我们可以判断为G1肿瘤，我们没有观察到基质金属蛋白酶的活性9.对于G2肿瘤，活性MMP9存在于7（）案例和仅适用于4（）。要求活性MMP2的外观索赔3 G1案例（），在G2的所有样品中和10g3例（Z 11）。

密度计量测量还证实，对于良好分化的肿瘤基质金属蛋白酶的活性低于G2和G3（）。MMP2的活性分别为G1：3。;G2：16。;G3：.2（）。没有报道MMP9的活性对于G1肿瘤，以及其它组分别为G2：;G3：。

4。讨论

在胰腺肿瘤中，我们观察了强烈的免疫细胞浸润。在胰腺癌中，据报道，巨噬细胞参与血管生成[10.]，支持肿瘤生长和侵袭癌细胞。它们是VEGF等血管生成因子的来源，也可以降低细胞外基质的MMP9。TDHE重要事实是巨噬细胞可以抑制T细胞反应。因此，渗透胰腺肿瘤的巨噬细胞是产生转移的重要因素。我们发现，巨噬细胞数量在淋巴结转移组中较高。该观察支持关于巨噬细胞参与创造转移的陈述。

丰富的生长因子表达是胰腺癌组织的典型。当他们参与受受体酪氨酸激酶介导的信号传导途径时，它们可能会调节细胞增殖，迁移和存活。以前关于表达增长因素的研究和有趣的观察。据报道，高水平的EGF和EGFR与淋巴结受累和远处转移以及中位生存期有关[11.]。仅在血清中PDGF-BB高水平的情况下才有利于预后[12.]肿瘤中的高表达与胰腺癌生长减少有关[13.]。在我们的研究中，我们观察到增长因素的强烈表达;但是，只有对于C-Met受体，我们能够在G2和G3组之间索取统计学上显着差异。关于淋巴结转移没有观察到显着差异。

我们的结果表明，C-MET可能是胰腺癌中的枢轴元素。该受体酪氨酸激酶通过HGF和生理学上激活，它参与胚胎发育，也在成年生命期间在肝再生和伤口愈合期间[14.]。然而，即使在致癌癌的早期阶段，它在胰腺癌中观察到其过度表达也在致癌中的早期阶段[15.]。

C-MET活化导致增加增殖，增强的运动和侵袭。因此，我们假设G2和G3阶段之间的C-Met表达的增加表明了更具侵袭性的表型，这可能与上皮间充质转变有关。EMT通常被认为是转移的第一步，因为它与降低的E-Cadherin表达和N-cadherin的外观有关[16.]。

另一个因素与淋巴结纳入巨噬细胞的存在 - 这也被我们的研究证实。我们的结果表明，淋巴结转移的组中巨噬细胞量显着高，因为它以前报道了[17.]。最近已经表明巨噬细胞也参与EMT过程[18.]。它们不仅表达EMT诱导的细胞因子，还表达了MMP9，即切割E-Cadherin /-catenin复合物。Tan等人。建议通过破坏地下室膜，巨噬细胞MMP9也支持EMT。这是侵袭癌细胞到其他组织的关键机制。

我们对MMP的活动分析表明，MMP2对胰腺癌的发展产生了更大的影响。即使在肿瘤的早期阶段也可以观察到其活性。在G2和G3组中仅观察到MMP9的相反活动。先前据报道，MMP2增加癌细胞迁移的能力[19.[胰汁中MMP2活性的测定被告知可用于诊断胰腺癌[20.]。MMP9与转移和血管生成有关[21.]。在G1组中缺乏其活动可能表明它在肿瘤的后续阶段被触发。

结论

在我们的研究中，我们证明了影响肿瘤微环境C-MET受体的许多因素，浸润巨噬细胞و和MMP2对胰腺癌的发育和侵袭具有显着影响。他们所有人都可能有助于EMT，我们打算在进一步的研究中审查这一点。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

致谢

该想感谢Anna Nasierowska-Guttmejer教授和Dorotałęcka博士的肿瘤组织病理学评估。本研究是以科学和高等教育部的支持进行了支持，授予NO。NN404 / 0693/33。

参考资料

1. M. M. Mueller和N.E.Fusenig，“癌症肿瘤基质的朋友或敌人 - 双相效应”自然评论癌症，卷。4，不。11，PP。839-849,2004。查看在：出版商网站|谷歌学术
2. J.P.Neoptolemos，R. A.Frrutia，J.Bebruzzese和M.W.Büchler，胰腺癌，斯普林斯，2010年。
3. T. Welsch，J.Kleeff和H. Friess，“胰腺癌的分子发病机制：进步和挑战，”目前的分子药，卷。7，不。5，pp。504-521,2007。查看在：出版商网站|谷歌学术
4. B. Z.Q.Qian和J. W. Pollard，“巨噬细胞多样性增强了肿瘤进展和转移”，“细胞，卷。141，没有。1，pp。39-51,2010。查看在：出版商网站|谷歌学术
5. J. W. Pollard，“肿瘤教育的巨噬细胞促进肿瘤进展和转移”自然评论癌症，卷。4，不。1，pp。71-78，2004。查看在：谷歌学术
6. M. egeblad和Z.Werb，“癌症进展中基质金属蛋白酶的新功能，”自然评论癌症，卷。2，不。3，pp。161-174,2002。查看在：谷歌学术
7. Y.Sullu，G. G. Demarag，A. Yildirim等，“基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9在乳房的侵袭性导管癌中表达”，“病理学，研究和实践，卷。207，pp。747-753，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术
8. H. Koyama，H.Iwata，Y.Kuwabara，H.Iwase，S. Kobayashi和Y. Y.FJII，“卵黄素癌的基质金属蛋白酶-2和-9中的凝胶溶解活性;使用原位酶谱进行的研究，“欧洲癌症杂志，卷。36，不。16，pp。2164-2170,2000。查看在：出版商网站|谷歌学术
9. V. Ellenrieder，B. Alber，U. Lacher，S. F. Hendler，A. Menke，W.Bock等，“MT-MMP和MMP-2在胰腺癌进展中的作用”，“国际癌症杂志，卷。85，pp。14-20,2000。查看在：谷歌学术
10. I. Esposito，M. Menicagli，N. Funel等，“炎性细胞有助于胰腺导管腺癌中的血管生成表型，”临床病理学杂志，卷。57，没有。6，pp。630-636,2004。查看在：出版商网站|谷歌学术
11. A. Pryczynicz，K.Guzińska-Ustymowicz，A. Kemona和J.Czyzewska，EGF和EGFR的表达与胰腺导管癌的转移相关，“抗癌研究，卷。28，不。2，pp。1399-1404,2008。查看在：谷歌学术
12. N.Rahbari，T.Schmidt，C.S.Falk等人，“血管生成细胞因子在胰腺癌中的表达和预后价值”，BMC癌症，卷。11，2011年第286号。查看在：出版商网站|谷歌学术
13. M.F.McCarty，R.J. Somcio，O. Stoeltzing等，“PDGF-BB的过度表达通过增加肿瘤周刊含量降低结肠直肠和胰腺癌生长”临床调查杂志，卷。117，没有。8，pp。2114-2122,2007。查看在：出版商网站|谷歌学术
14. A. Gentile，L.Trusolino和P.M. Comoglio，“符合酪氨酸激酶受体在发育和癌症中，”癌症和转移评论，卷。27，不。1，pp。85-94,2008。查看在：出版商网站|谷歌学术
15. J. Yu，K. Ohuchida，K.Mizumoto等，“胰腺癌早期C-Met过表达的”过度表达;改变的表达不足以使慢性胰腺炎的进展到胰腺癌，“世界胃肠学杂志，卷。12，不。24，PP。3878-3882,2006。查看在：谷歌学术
16. J.P.Thiery，“肿瘤进展的上皮 - 间充质转变，”自然评论癌症，卷。2，pp。422-4454,2002。查看在：谷歌学术
17. H.Kurahara，H.Shinchi，Y. Mataki等，“M2 - 偏振肿瘤相关巨噬细胞在胰腺癌中的意义”，外科研究杂志，卷。167，没有。2，pp。E211-E219，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术
18. T.K. Tan，G. Zheng，T.T. Hsu等，“巨噬细胞基质金属蛋白酶-9在小鼠肾小管细胞体外介导上皮 - 间充质转变，”美国病理学杂志，卷。176，不。3，pp。1256-1270，2010。查看在：出版商网站|谷歌学术
19. V. Ellenrieder，B. Alber，U. Lacher，S. F. Hendler，A. Menke，W.Bock等，“MT-MMP和MMP-2在胰腺癌进展中的作用”，“国际癌症杂志，卷。85，pp。14-20,2000。查看在：谷歌学术
20. M. Yokoyama，K.Ochi，M.Ichimura等，“胰腺中的基质金属蛋白酶-2，用于诊断胰腺癌”胰腺，卷。24，不。4，pp。344-347，2002。查看在：出版商网站|谷歌学术
21. T. Nakamura，T.Kuwai，J.S.Kim，D. Fan，S. J. Kim和I. J. Fidler，“基团，”基质金属蛋白酶-9对帕拉西裸鼠的原位人类胰腺癌的血管生成和逐渐生长至关重要“瘤瘤，卷。9，不。11，pp。979-986,2007。查看在：出版商网站|谷歌学术

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