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体积 2020. |文章的ID 8873614 | https://doi.org/10.1155/2020/8873614

阮Thi Thoa, Nguyen Hai Dang, Do Hoang Giang, Nguyen Thi Thu Minh, Nguyen Tien Dat 天然和商品的鉴别和质量控制的代谢组学方法Fallopia野蔷薇产品在越南",国际分析化学杂志 卷。2020. 文章的ID8873614 8 页面 2020. https://doi.org/10.1155/2020/8873614

天然和商品的鉴别和质量控制的代谢组学方法Fallopia野蔷薇产品在越南

学术编辑器:GüntherK.波恩
收到了 4月11日4月11日
修改 2020年8月27日
接受 2020年10月26日
发表 06年11月2020年

摘要

建立了以hplc - dad为基础的精确定量和代谢组学统计方法,用于鉴别和控制药材质量Fallopia野蔷薇在越南是一种很受欢迎的药材。采用层次聚类分析、主成分分析等多变量统计方法对6个天然样品和12个商品样品进行了比较和鉴别。2、3、4,5-Tetrahydroxystilbene 2 -O-β-D-glucopyranoside (THSG)(1),大黄素(4),以及新化合物6-羟羟化素8-O-α-D-apiofuranosyl -(1⟶6)β-D-葡糖吡喃糖苷(5)可以被认为是分类的重要标志野蔷薇。此外,量化了七种酚菌素,即所选代谢物的内容物的变化显示出自然和商业样本质量的差异。从分析物中恢复化合物的含量大于98%,而检测限(LOD)和定量限额(LOQ)的限值范围为0.5至6.6 μG /ml, 1.5 - 19.8μ胃肠/ ml分别。线性,LOD,LOQ,精度和准确性满足了生物分析方法的标准FDA指导。总的来说,这种方法是一个有前途的歧视和质量保证工具f .野蔷薇产品。

1.介绍

Fallopia野蔷薇Haraldson, Polygonum multiflorum thumb的同义词。,is a well-known traditional medicine in several South Asian countries. The roots of this plant have been used to promote hair growth and enhance liver and kidney functions [1].以往的研究报道了主要化合物,即2,3,4′,5-四羟基二苯乙烯2-O-β- d -吡喃葡萄糖苷(THSG)和大黄素可能具有肝保护作用[2- - - - - -4,抗衰老的56,以及抗氧化活性[7].THSG和其他斯蒂芬也显示出抗药物肺血症效应[8],而大蛋白表现出显着的抗癌,抗炎和滋补张力抑制作用[910.].此外,还分离出多酚类、黄酮类、糖苷类、单宁类、甾体类等化合物f .野蔷薇具有显著的抗氧化、免疫调节和脑血管保护作用[9- - - - - -14.].通常,根f .野蔷薇是与黑豆一起蒸制而成,因此,THSG的含量下降了一半以上[15.].近年来研究表明,大黄素、大黄素-8-含量较高O-葡萄糖苷和没食子酸在高温下可显著降低因此,降低其抗氧化活性[16.17.].植物化学品f .野蔷薇可能因地理起源而变化最近的一些研究表明,由于植物的来源不同,THSG、大黄素和物理学的含量可能有很大的不同[18.- - - - - -20.].hplc -指纹色谱和LC-MS代谢组学方法是常用的地理和加工鉴别方法F. multiflora,其中清晰地显示了能够准确区分样本的标记[21.22.].

在越南,f .野蔷薇已广泛用于原材料或加工产品[23.].但是,没有有效的方法来分类,识别和控制商业质量f .野蔷薇产品在越南。最近,我们报道了其酚类成分f .野蔷薇包括thsg(1), physcionin (2),大黄素8-葡糖苷(3.)和大蛋白(4),pleuropyrone (6),Torachrysone 8-O-β-d-葡糖吡喃糖苷(7)和萘啶衍生物6-羟基硫胺8-O-α-D-apiofuranosyl -(1⟶6)β-d-葡糖吡喃糖苷(5) (数字1)[24.].在本研究中,我们在酚类内容物上进行了HPLC分析,并应用了统计方法来区分自然根源和商业药物切片f .野蔷薇.此外,还对这些化合物的含量进行了定量分析和比较。

2。材料和方法

2.1。样品制备

6个3- 4年的天然根样本F. multi fl Ora,编码NAT_1至NAT_6,于2015年10月在越南北部山区省省六个山区六区收集。这些样品被杜邦博士,越南科学院生态学研究所和生物资源研究所和生物资源研究所识别技术。商业药物切片(CMS)野蔷薇,编号为CMS_1 ~ CMS_12的药品是2015年11月在越南河内韩药店购买的。样品切成粉后,在30°C超声条件下用甲醇提取3次,每次5 g。将滤液全部浓缩,用甲醇补齐至20ml。必要时可将样品稀释。所有溶液通过0.45过滤μm安捷伦econfilters(安捷伦技术,美国),然后注射到HPLC系统。每个样品进行三次重复分析。

2.2。准备校准标准

七个标准化合物(图1)被隔离F. multi fl Ora如前一篇文章中所述[24.].通过HPLC分析(数据未显示),在95%以上评估这些化合物的纯度。在5-1000的浓​​度范围内制备每个标准化合物的校准溶液 μ克/毫升。化合物的质量控制样品在25μg / ml, 125μg / ml,500 μ克/毫升。

2.3。仪器

hplc级溶剂从Scharlau(西班牙)和Merck Millipore(德国达姆施塔特)获得。HPLC-DAD数据是在Agilent系列1260 (Agilent Technologies, USA)系统上获得的,该系统由真空脱气器、四元混合泵、自动进样器、柱箱和二极管阵列检测器(DAD)组成,使用ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱(150 mm x 4,6 mm, 5μm)配备ZORBAX Eclipse XDB C18防护柱(12.5 mm × 4.6 mm, 5μm)(安捷伦科技,美国)。以0.1% v/v的乙酸水溶液(流动相A)和甲醇(流动相B)的混合物为流动相。

2.4。线性,lod和loq

在此浓度范围内进行了三次独立的线性评价。每一种分析物的校准曲线必须具有至少0.999的相关系数(R2)。检出限(LOD)为可能鉴定出的标准化合物的最低浓度。同时,定量限(LOQ)说明了可能被定量的分析物的最低浓度。根据响应的标准差(SD)和校准曲线的斜率,利用校准曲线得到LOD和LOQ,公式如下: 在哪里σ为数据响应的标准推导,a为校准曲线的斜率。

2.5.精密度和准确度

通过分析低、中、高浓度质量控制样品在25、125和500的6个重复的响应来评估日内变化μg/ml,而用连续3天的HPLC注射质量控制样品来评估日间变化。用变异系数(CV%)评价测定的精度,变异系数由重复浓度的标准偏差与平均浓度的比值计算得出。准确度是从已知化合物含量的样品中加入标准品的回收率来计算的。用上述方法对混合物进行提取和分析。试验进行了六次重复。

2.6。数据处理和统计分析

数据采集​​和处理由Agilent ChemStation(Agilent Technologies,USA)和Microsoft Excel 2016(Microsoft Corporation,USA)进行。在统计部12(戴尔软件,美国)和R包(统计计算,维也纳,奥地利)分别执行主成分分析(PCA)和分层聚类分析(HCA)。

3.结果与讨论

3.1.HPLC-DAD条件的优化

进行了HPLC-DAD系统的优化策略,以获得色谱图上的化合物的分离峰(图2).使用ZORBAX Eclipse XDB C18柱(150mm x 4,6mm,5)分析所有分析物在安捷伦系列1260系统上分析所有分析物 μm)配备ZORBAX Eclipse XDB C18防护柱(12.5 mm × 4.6 mm, 5μm)保持在30℃。0.1% v/v的乙酸在水和甲醇中呈线性梯度的混合物对所有分析物的分离和峰形都有较好的表现。流速设置为0.5 ml/min,在40分钟内线性梯度从30到100%甲醇,然后用100%甲醇洗涤5分钟,初始条件5分钟。每个样品的进样量为5μ湖UV检测器同时设定为320nm(用于测定化合物(1)(5),(7))和280nm(用于识别化合物(2)(3)(4),(6)).各化合物的保留时间(Rt)见表1


被分析物 RT(分钟) C (μg / ml) 盘中(n= 6) Interday (n= 6)
精度(CV %) 准确度(%来自回收率)平均值±标准差 精度(CV %) 准确度(%来自回收率)平均值±标准差

(1) 12.7 25. 0.7736 100.19±4.98 1.7772 98.68±8.35
125. 0.1587 98.68±2.36 0.6515 100.64±2.17
500. 0.9496 99.49±0.82 0.8775 99.61±1.95

(2) 24.3 25. 1.7564 99.94±4.82 1.6769 100.86±5.14
125. 0.1958 99.93±2.04 0.7853 99.82±2.04
500. 0.0788 99.97±0.32 0.1215 100.42±0.57

(3) 26.5 25. 1.0490 99.38±4.03 1.4874 99.28±3.3
125. 0.5440. 98.4±0.99 0.5175 98.9±0.94
500. 0.2066 99.48±0.49 0.2465 98.97±0.54

(4) 35.3 25. 0.3930 98.37±2.6 0.5160 98.42±5.16
125. 0.0768 98.58±0.91 0.2293 99.27±1.22
500. 0.0671 100.05±0.42 1.4881 100.52±0.64

(5) 15.7 25. 3.4528 99.64±3.12. 3.4721 102.99±6.06
125. 1.2993 100.71±1.05 1.2698 98.1±2.73
500. 0.9496 100.13±0.29 0.7438 103.09±0.54

(6) 16.4 25. 1.8823 98.23±4.37 1.7781 99.05±4.42
125. 1.2309 100.56±1.27 1.2267 101.02±1.40.
500. 0.3624 99.8±0.41 0.3514 99.97±0.43

(7) 21.0 25. 2.2353 100.45±4.99 2.0892 98.7±8.22
125. 1.3567 99.54±1.78 1.1548 99.54±1.78
500. 0.9318 99.77±0.25 0.7520 98.75±0.80

3.2。验证方法

通过绘制峰值区域与浓度相比,从至少六种合适的浓度建立每个化合物的校准曲线。可以在表格中看到2,所有校准曲线都显示出具有平均确定系数的优化线性(R2)高于0.999。LOD值确定在0.4至6.6之间 μG / mL说明了足以确定内容物的分析方法的高灵敏度F. multi fl Ora样本。


被分析物 拦截 R2 LOD (μg / ml) loq(μg / ml)

(1) 6.1379 3.9659 0.9999 0.5106 1.5474
(2) 4.0861 21.5671 0.9998 0.4997 1.5143
(3) 2.0617 9.3186 0.9996 0.7349 2.2269
(4) 6.6230 -35.4954 0.9998 6.6000. 19.8000.
(5) 1.0218 0.7870. 0.9999 1.3600 4.1212
(6) 2.3317 6.8226 0.9999 1.4333 4.3435
(7) 0.9279. 2.4082 0.9998 1.5736. 4.7684

实验进行了三个重复。

精密度和准确度结果如表所示1.日内和日间精度(CV%)值在0.05% ~ 3.5%之间,而回收率计算的精度值分布在98% ~ 103%之间。这些结果显示了可接受的精密度和准确度,符合FDA生物分析方法指南[25.].因此,所建立的方法适用于样品中所选化合物的同时定量野蔷薇。

3.3。代谢组学和量化f .野蔷薇样品

利用代谢组学对大量样本进行相似性和差异性分析。本研究从18个样品的色谱图中提取7种化合物在选定波长的峰面积,并转移到片剂形式进行层次聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA),用于天然和商业切片的鉴别野蔷薇。基于由峰面积值表示的七种化合物的含量的差异进行HCA。在HCA Dendrogram上说明的R包装软件上计算了18个样本中的欧几里德距离(图3.).可以看出,在HCA树状图上,6个自然样本组与商业切片样本组差异显著。同时,商业药用切片样品在CMS_06、CMS_08 ~ CMS_10、CMS_11 ~ CMS_12和其他CMS样品之间聚类清晰。

另一方面,PCA得分图(图4(a))也急剧分为两个区域代表的天然样品和其他商业样品,而CMS样品也分为四个簇,在PCA图上,其在HCA树状图上类似于类似的。从Scree Plot可以看出(图5),前两个主要成分(PC)占样品总变化的90%以上。因此,我们假设这些PC携带变量的主要信息。大大,CMS_06被确定为PCA图上的特定样品。这些结果表明了天然和商业产品之间的标准化合物的内容差异野蔷薇。此外,CMS样品可以分为四个CMS组:第1组:CMS_06;第2组:CMS_08至CMS_10;第3组:CMS_11至CMS_12;第4组:基于PCA和HCA的结果,CMS样本的其余部分。用于聚类的标记化合物可以根据PCA负载图识别(图4(b))。可以看出,大黄素(4), THSG(1)和6-羟基羟嗪8-O-α-D-apiofuranosyl -(1⟶6)β-D-葡糖吡喃糖苷(5)可以清楚地检测为标记化合物以区分F. multi fl Ora样本。

进一步解释样品中歧视的歧视使用上述方法量化七种选定标准的内容。结果计算并在表中概述了3.


团体 样本 含量(mg/kg干重)
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

自然的样品 Nat_1 55010±2525 3183±135.5 1404±72.59 438.13±14.09 173.4±9.13 117.0±6.23 398.0±17.03
Nat_2 46946±3188 3175±234.3. 1368±48.97 333.5±14.54 148.7±4.99 100.6±3.34 383.5±9.04
Nat_3 50491±2826. 3170±155.2 1399±86.74 268.3±14.37 170.5±10.84 115.5±7.32 342.1±11.49
Nat_4 33660±2393 3190±260.3 1405±53.36. 354.2±23.93 149.6±7.12. 117.3±5.25 411.3±23.68
Nat_5 29176±1923 3199±216.2 1386±86.71 457.9±14.92 155.7±5.07 131.4±4.63 361.7±22.64
Nat_6 26211±678.9 3223±192.0 1375±35.47 404.8±26.64 157.8±8.81. 114.6±6.50. 459.6±21.05

CMS组1 CMS_06. 1698±111.9 + + 547.0±25.65 35.73±1.30 + ND

CMS组4 CMS_01 1170±66.92. ND + + 20.41±0.97 + +
CMS_02 2160±207.1 + ND + 25.64±0.58 + +
CMS_03 507.0±23.27 + + + ND ND ND
CMS_04 2285±145.3 + + + 43.37±1.55. ND ND
CMS_05 3285±282.2 + + + 38.81±1.78 + ND
CMS_07. 2418±110.7 + + + 39.40±1.45 ND ND

CMS组2 CMS_08 9094±435.1 985.0±45.11 326.6±14.96 93.89±2.97 62.67±2.61 63.57±3.00 219.2±11.33
CMS_09. 11854±965.8 907.2±32.28 351.2±11.52. 104.3±3.48 75.11±1.76. 71.00±2.01 202.7±6.77
CMS_10 10470±692.1. 818.6±53.75 340.7±24.57 119.0±4.26 90.48±3.93. 78.21±3.86 198.3±4.65

CMS组3 CMS_11 5335±298.2 427.4±22.98 234.3±3.68 112.6±4.89. 34.81±1.51 42.87±1.73 139.6±7.46
CMS_12 4770±328.6 508.9±40.50 203.5±10.29 99.67±1.28 29.81±0.96 52.27±2.05 153.3±6.46.

分为HCA和PCA。 实验进行了三个重复。+:定量范围内可识别;未检测到。

每种化合物的含量差别很大F. multi fl Ora样本。THSG.(1)天然样品的含量在26211 ~ 55010 mg/kg之间,是CMS样品的4 ~ 108倍。THSG含量在上述类群间也存在较大差异。在4个CMS组中,CMS 2组的THSG含量最高,在9,000 mg/kg以上,其次是CMS 3组,在5,000 mg/kg左右,而CMS_01 ~ CMS_07 (CMS 1组和CMS 4组)的THSG含量在507 ~ 3,285 mg/kg之间变化不大。以前的研究也报告说,三苯乙烯的含量可能在8000到60000毫克/公斤的天然F. multi fl Ora,而在商业样本中则大幅降低[16.18.21.].化合物的含量,6-羟基硫胺8-O-α-D-apiofuranosyl -(1⟶6)β-D-葡糖吡喃糖苷(5)天然样品中化合物含量显著高于其他CMS样品,而CMS 2组中化合物含量最高。相当低或不含物理碱(2),大黄素8-glucoside(3), pleuropyrone(6),八裂霉素8-O-β-D-葡糖吡喃糖苷(7)在CMS组1和4的样品中测定,而天然样品显示出这些代谢物的最高含量,其比CMS组2和3的值高至少3倍。有趣的是,大黄素(4)在CMS_06 (CMS组1)样品中含量最高,其次为自然样品、CMS组2和CMS组3,而在CMS组4中含量较低。该化合物可能是有用的标记,导致样品CMS_06在PCA评分图上与其他分析物的清晰分离。加工研究F. multi fl Ora说明有或无黑豆长时间蒸后,大黄素含量可增加20-30% [15.].因此,CMS_06可以在相关条件下处理,该条件急剧增加了大黄素的合成。

总的来说,除大黄素外,其他6种标准品在天然样品中含量较高,可能导致CMS样品的鉴别。CMS组样品的聚类可根据THSG含量的不同而定(1), physcionin(2),大黄素8-glucoside(3),6-羟基羟色素8-O-α-D-apiofuranosyl -(1⟶6)β-D-葡糖吡喃糖苷(5), pleuropyrone(6),八裂霉素8-O -β-D-葡糖吡喃糖苷(7),其中CMS组2分别包含比CMS组3和4更高的标准含量。CMS组1仅包括样品CMS_06,通过显着高的大蛋白含量分类(4).6-羟基木精苷8-含量变化较大O-α-D-apiofuranosyl -(1⟶6)β-D-葡糖吡喃糖苷(5)在分析物中,呈现与THSG相似的趋势(1因此,可以用作分类的新标记F. multi fl Ora.一般来说,商业F. multi fl Ora通过用黑豆蒸发或储存在未跳跃的条件下,处理产品,这显着降低了代谢物的含量[9].之前的研究报道,50%的二苯乙烯含量在高温处理后可能会分解,这大大降低了毒性F. multi fl Ora15.].而大黄素和三聚氰胺已被证实为主要的抗癌、抗氧化和抗病毒药物F. multi fl Ora25.- - - - - -36..T.胡斯说,这些化合物的减少可能导致药物质量的严重下降。此外,研究结果还表明,CMS样品中THSG含量存在一定的变化,其中天然样品中THSG含量可能高达CMS样品的108倍。之前的一项研究F. multi fl Ora还说明了天然和商业加工产品之间的主要代谢产物的含量高差异。因此,自然根源的THSG或大黄素含量高于商业产品的130倍[22.].本研究中CMS样品组成的变异表明商业的质量F. multi fl Ora由于不同的加工或保存方法,在制造业之间可能显着变化。因此,应进行进一步的研究,以清楚地解释这些问题的原因和后果。

4。结论

首次采用基于HPLC-DAD的代谢组学方法来鉴别黄芪的天然和商业药用片F. multi fl Ora根在越南。此外,还对7种成分进行了定量分析,以评价天然样品和商品样品的质量。用这种方法,自然F. multi fl Ora样品与商业样品有明显的区别。两类样品中7种代谢物的含量差异较大,表明两类样品中7种代谢物的含量差异较大F. multi fl Ora加工和制造中的化学成分。另一方面,基于商品样品标准代谢物差异的鉴别,表现出相当大的差异F. multi fl Ora制造业之间的质量。因为F. multi fl Ora是一种常见的传统医学,其质量需要严格控制。除了大蛋白和THSG,有趣的是,新化合物,6-羟基嗪8-O-α-D-apiofuranosyl -(1⟶6)β- d -吡喃葡萄糖苷作为鉴别标记。总之,本研究提供了一种准确区分天然和商业的有效方法F. multi fl Ora产品的质量评价,也可应用于其他多种中药材的质量评价。

数据可用性

所有支持这项研究结果的数据都包含在文章中。

利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了越南科学技术研究院的部分支持(授权代码VAST.UDCN.05/14-16)。

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