牛皮质膜在大鼠颅骨严重缺陷中的促骨能力:组织学和免疫组化分析

摘要

帮助引导骨再生(GBR)过程的膜一直是有助于这一修复过程的相容性生物材料研究的主题。本研究通过评估GBR以及组织学、组织形态测量学和免疫组化反应，比较了用于大鼠颅骨临界大小缺陷的不同膜。48只雄性白化Wistar大鼠随机分为4组(n= 12个)，即C:无膜对照组(仅血凝块，阴性对照组);BG:猪胶原膜组(Bio-Gide®阳性对照组);GD:牛皮质膜组(第一实验组);GDF:较厚的牛皮质膜组(第二实验组)。术后30、60 d对大鼠实施安乐死。从组态分析的定量数据提交双向方差分析和Tukey后测 ．较厚的牛皮质膜在30和60天的组织形态测量结果是有希望的，显示改善的新骨形成值( ），而CD组在两个分析期间的结果相似，仅超过GDF组( ）。免疫组织化学结果与组织素质数据有关。较厚的膜也有助于GBR。所有膜均促进GBR，尤其是阳性对照和实验组。

1.介绍

骨容量不足是成功种植体康复的主要挑战之一[1］．拔牙后牙槽骨的垂直和水平尺寸发生改变，颊骨板的再吸收在拔牙后不久更明显[2］．在人类中，拔牙后12个月水平尺寸明显减少50%，最明显的损失发生在愈合的前3个月[3.］．

20世纪80年代，人们对植牙治疗的需求增加，刺激了植骨外科技术的发展和完善，包括牙槽嵴保存程序[4]、牙槽骨牵张和引导骨再生(GBR) [5，6］．GBR是基于使用resorbable或nonresorbable屏障膜,防止某些类型的细胞的迁移到骨缺损区,如快速增长的上皮细胞和结缔组织,有利于osteoprogenitor的增殖细胞能够执行骨赘生物(5，6］．

在GBR中使用的膜是处理过程中必不可少的组成部分。膜必须具有生物相容性，具有允许等离子体和营养物质扩散的多孔性，并且必须是防止上皮细胞入侵的屏障[6］．它还应该在凝块形成过程中保护脆弱的血管网[7]，保持尺寸稳定，以支撑其重量，并抵抗邻近组织的压力。这些属性防止了临界空间的坍塌和随后的消除[6，8，9］．

屏障生物材料可以由多种材料制成[6］．合成聚合物，如膨胀聚四氟乙烯(e-PTFE)，是第一批用于GBR膜的材料[6］．除了在愈合过程中防止侵袭结缔肌的能力之外，这些生物材料足以刚性刚性，以产生骨质发生空间[6］．然而，它们可能过早接触口腔，导致骨移植材料污染和骨再生困难[9，10］．

为了克服这些障碍，人们研制出了由天然聚合物组成的膜[6］．这些膜的胶原可以来自牛或猪的不同组织，包括肌腱、真皮、心包和小肠[10，厚度约为0.5至1毫米，供临床使用[11］．这些膜的优点包括止血、对牙周韧带成纤维细胞和牙龈成纤维细胞的趋化、免疫原性低、易于操作和适应、能够增加组织厚度[10］．

胶原经过巨噬细胞和多形核白细胞的酶降解，产生二氧化碳和水[10，11］．膜的吸收是一个重要特征。如果骨吸收发生在骨新形成之前，它会导致骨移植物的空间稳定性丧失和消散，从而损害GBR。然而，由于非功能膜降解产物的形成，延迟的再吸收可能不利于伤口愈合[10］．

牛皮质骨源的I型胶原膜由组织耐受良好耐受[12- - - - - -14］．30 - 60天后，单核细胞和多核细胞明显会完全重吸收[15］．最近，新一代的这种膜问世了。膜厚度的增加改善了GBR工艺。

若干因素可能会干扰骨骼生物动力和重建GBR的骨骼框架。本研究的目的是评估三个胶原膜的骨催化剂电位，牛皮质骨的两个膜，具有不同的厚度（Genderm®和GendermFlex®）和猪胶原膜（Bio-Gide®），在过程中在大鼠Calvaria的临界骨缺陷安装后GBR [13- - - - - -16使用组织形态测量学和免疫组化分析在30和60天。

2.材料和方法

本研究由Araçaatuba牙科学校，媒体宣传议员（00217-2016）的艺术学院（00217-2016协议）批准，并随后到达指导方针。

48只3至4个月大的雄性成年大鼠(鼠形阿尔昆使用重量约200至300g至300g的Wistar。将大鼠随机分成4组（每组12只大鼠）。他们被安乐死了30天（n= 6)或60天(n = 6) after surgery. The rats were kept in cages, with 3 animals per cage, and fed a balanced diet (NUVILAB, Curitiba, PR, Brazil) containing 1.4% calcium and 0.8% potassium, and they had free access to water at the vivarium of the School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), Araçatuba.

２．１．外科手术

手术于上午在圣保罗州立大学(São Paulo State University)牙科学院(UNESP)进行，Araçatuba。术前禁食12小时，肌肉注射盐酸氯胺酮(弗朗索酮50 mg/kg;Vibrac do Brasil Ltda, São Paulo, Brazil)与xylazine (5 mg/kg Rompun;拜耳S. A.动物健康，São保罗，巴西)。在头盖骨区域进行三分术;使用聚乙烯吡咯烷酮碘(PVPI, 10%碘;Rioquímica, São José do里约热内卢Preto，巴西)和局部PVPI (10% Riodeine;Rioquímica, São José do里约热内卢Preto，巴西)，并将老鼠放置在无菌场地。

在头盖骨前部的头皮上做一个每侧约1cm的v型切口，可以在后向反射全层皮瓣。使用内径为7mm的环钻(3i Implant Innovations, Inc.， Palm Beach Gardens, USA)在低速手机中制造一个直径为8mm的临界尺寸缺陷，并使用无菌生理盐水进行连续冲洗。颅骨中央部分的缺损涉及矢状线，以保持硬脑膜的完整性(图)1）。

每组由12只动物组成。在C（CLOT）组中，手术临界尺寸缺陷填充有血液凝块，没有过涂的缺陷。在BG（Bio-Gide®）组中，手术临界尺寸缺陷填充有血凝块，并被猪胶原膜覆盖（Bio-Gide®; Geistlich Pharma Ag，Wolhusen，瑞士）。在GD（Genderm®）组中，手术临界尺寸缺陷用血液凝块填充并被薄的牛胶原膜（Genderm®; Baumer S. A.，Mogi Mirim，巴西）覆盖。在GDF（GendermFlex®）组中，手术临界尺寸缺陷填充血凝块并被厚牛胶原膜（GendermFlex®; Baumer S. A.，Mogi Mirim，Brazil）覆盖。

手术后，将软组织小心复位，使用可吸收缝线(聚乳酸，Vicril 4.0;Ethicon, Johnson Prod.， São José dos Campos，巴西)的深层，以及单丝线(mononylon, Nylon 5.0;Ethicon, Johnson Prod.)间断缝合线在最外平面使用。

在术后即刻，每只动物接受单次肌注0.2 ml青霉素G苄星(小动物兽医Pentabiotic;道奇堡Saúde动物有限公司。(巴西SP Campinas)。

通过过量的麻醉剂（硫喷妥牙，150mg / kg），在术后30和60天安乐死。除去Calvaria并在10％甲醛溶液中设定48小时，在自来水中洗涤24小时，在20％EDTA中脱钙5周，含醇溶液和透明液体。将制备的Calvaria沿纵向切割在中间，以分离骨缺陷。将所得碎片单独加入到石蜡中，6 μ.获得M厚截面。切片用苏木精和伊红染色。

2．2．形态分析

使用×6.3，×12.5，×25和×40镜头的双目光学显微镜进行所有形态学分析，带有附着的Axiocam ICC相机（Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）来记录组织切片的图像。

用显微镜分析手术伤口的中心区域。通过目测肉芽组织/年轻纤维结缔组织、新形成的血管、成纤维细胞、成骨细胞和矿化骨基质、异物型肉芽肿、巨噬细胞和炎性多核巨细胞的存在或缺失进行定性分析。

2．3．Histomorphometric分析

在组织形态分析中，每组12个刀片每个周期(术后30和60天)进行评估。测量使用光学显微镜(R DMLB;Leica Microsystems Ltd.， Heerbrugg, Switzerland)和一个附加的图像捕捉相机(R DC 300F;徕卡微系统有限公司)。图像以TIFF文件存储，并使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，Bethesda, MD, USA)进行分析。对所有骨缺损延伸部位的骨组织面积进行评估。从分析中获得的数据被转换为像素的绝对值到百分比的统计检验，以减少负尺寸差异的干扰。

2．4．统计分析

所有测试均使用SigmaPlot 12.3 (Systat Software, Inc.， San José， CA, USA)进行。最初，数据被提交到正态性测试(Shapiro-Wilk)，该测试识别同质数据( ）。双向ANOVA测试用于因子（“膜”和“时期”）和“膜×时期”相互作用。此外，为了准确识别统计变化，Tukey的PostTest是应用的。所有测试所采用的重要性水平为5％。

2．5．免疫组织化学分析

免疫组化检测免疫过氧化物酶活性。过氧化氢抑制内源过氧化物酶活性。随后，用磷酸柠檬酸缓冲液(pH 6.0)对载玻片进行抗原恢复处理，并用脱脂奶粉阻断内源性生物素。一种抗体是针对骨钙素(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)和骨桥蛋白(Santa Cruz Biotechnology)的。多克隆生物素化山羊二级抗体由驴子(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA)产生，与亲和素和生物素放大器试剂盒(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)一起使用。用二氨基联苯胺(Dako, Carpinteria, CA, USA)作为显色剂。此外，在Harris苏木精的切割染色下进行反应结束。对于每种抗体，根据骨修复过程中免疫标记的细胞数量，通过不同的评分，对相关蛋白的免疫标记强度进行半定量评估。分析采用上述R DMLB光学显微镜进行。免疫标记强度从1到4进行评分，1为不进行免疫染色，4为强烈标记。

3.结果

3．1．形态分析

结果通过光学显微镜评估了来自四组的载玻片标准化（图2和3.）。

3．1．1．C组

(我)30天:缺损边缘附近有明显的主要骨新生区域。临界缺损的中心被疏松结缔组织填满，并且没有建模。(2)60天:在缺损未完全闭合的情况下，缺损残根的近似程度明显提高。缺损中心由纤维结缔组织填充。

3．1．2．英国天然气集团

(我)30天:观察到大量新形成的骨组织，其中散布着Bio-Gide®猪胶原膜碎片。在刀片中，从骨残端和缺损中心形成的新骨很明显，在新形成的骨组织区域和在剩余膜上组织的结缔组织之间存在残余膜。在一些标本中，缺陷是闭合的。(2)第60天:与第30天的观察结果相似，在缺损的周围和中心有明显的新骨形成。然而，新形成的骨组织几乎填充了整个空腔。残膜和组织良好的纤维结缔组织。

3.1.3。GD集团

(我)30天:缺损区未修复，缺损中心处观察新生骨组织。在高倍镜下观察到膜碎片。膜碎片周围有明显的骨新形成区域。(2)60天：在大部分缺陷中检测到新的骨形成，但在只有一个标本中，缺陷的完全闭合是显而易见的。膜碎片罕见。

3.1.4。法国燃气集团

(我)30天:从残端到缺损中心，新骨形成明显。在缺损的周围，结缔组织仍被膜覆盖。在每个缺陷的顶部均观察到膜残留。在一些大鼠，膜包含有组织的结缔组织，有许多成纤维细胞血管化良好。在另一些病例中，新形成的骨组织出现在膜的内侧。膜外表面可见巨细胞。膜与新形成的骨组织之间还可见平行排列的结缔组织和成纤维细胞。在一些试样中证实了缺陷的闭合。(2)60天:在骨残端附近观察到一个大的骨新形成，内部有完全参与骨组织的膜残余，外部有纤维结缔组织。缺损中心的闭合在大多数标本中是明显的。然而，也观察到未闭合缺损的标本。在残膜附近观察到数量增加的巨细胞。

3．2.Histomorphometric分析

在组织形态学评估（图4）骨骼修复的时间顺序（Intragous分析），只有时间因素显示在GDF组（Tukey的测试中）在30至60天之间表现出统计学上显着差异; ）;另一组没有显示统计差异：GD（Tukey的测试; ），BG(图基的测试; ），和C(杜克测验; ），而GD组，GBR有改善的潜力。在组间分析中，与阳性对照组相比，GDF组表现出最佳的新形成骨值(Tukey’s test; ）;GD组和C组没有显示统计学差异(Tukey’s test; ）。

3.3。免疫组织化学分析

免疫组化分析结果如图所示5和表1并在下面详细介绍。

3.3.1。英国天然气集团

(我)骨桥蛋白:骨修复30天和60天的显微照片显示骨桥蛋白分别为轻(+)标记和中等(++)标记。(2)骨钙素：30和60天骨修复的显微照片揭示了骨骼树桩区域和缺陷中心的骨钙素生物标志物的强烈标记（+++）。

3．3．2．GD集团

(我)骨桥蛋白:30天后检测到中度活性(++)，表明修复过程的组织。60天后，轻(+)免疫标记显示骨基质形成减少。(2)骨钙素:30天骨修复以中间为中到高强度标记(++/+++)。结缔组织在此部位未发现矿化。在第60天，观察到大多数骨缺损的中度到强烈标记(++/+++)。

3.3.3。法国燃气集团

(我)骨桥蛋白(Osteopontin): 30天后，几乎所有的缺损都闭合，细胞和骨基质水平均检测到骨桥蛋白强烈标记(+++)。在第60天，一旦新骨形成确定，骨桥蛋白(+)在骨细胞中标记，几乎所有的缺陷都被轻标记闭合。(2)骨钙素:在30和60天观察到强烈标记(+++)。

4。讨论

GBR的主要目标是在骨缺陷面积中具有一致且成功的骨再生，并具有低的并发症风险。其次，GBR寻求获得较少的手术干预，患者发病率低的成功结果，修复期缩短。在过去的20年中，在GBR的技术和材料开发方面取得了重大进展，以预期的方式再生[17，18］．

控制性缺损(无膜的血块)的修复以标准的方式进行，骨形成被限制在缺损的边缘，中心被纤维结缔组织填充。随着膜形式的机械屏障的引入，新形成的骨和组织再生数量增加。这是由于分隔内皮和骨组织的屏障所产生的空间。最初由血块填充的缺损经历了愈合过程，与对照组缺损相比，这导致了更大的骨新形成[19，20.］．

临界尺寸的骨缺损被认为直径最小，并且在动物的整个生命过程中不会自发再生[21］．因此，只有真正能够帮助骨愈合的生物材料才会明显优于血块填充的对照组[14］．根据几项研究，本研究中创建的8毫米直径的骨缺损被认为是至关重要的[13，14，21，22和本文给出的结果。实验采用的安乐死时间为30天和60天，在其他研究中被认为是标准时间，代表了该动物模型骨组织修复的矿化和成熟时期[23，24］．

使用不同类型的膜在骨新形成的模式和数量上是否有差异?市面上有各种各样的GBR膜。材料的选择应根据临床需要，材料的基本特性应包括生物相容性、组织整合、空间形成和维护、易操作、不易发生并发症和细胞闭塞，避免不良细胞的侵袭，如成纤维细胞[6，8，10］．

胶原膜来自不同的牛或猪动物组织(肌腱、皮肤和肠)[6，25］．虽然胶原蛋白有许多优点，如免疫原性低、能够吸引牙龈成纤维细胞和生物相容性[10，25，降解速度高，胶原蛋白可能维持不了足够的时间来保证组织再生[6］．胶原膜的可预测性取决于胶原蛋白的类型和各种化学和物理方法，必须进行胶原蛋白消除杂质并稳定其组成原纤维，这是改善其机械性能并降低降解速率所必需的[6，10，25］．

BG组中使用的可吸收的Bio-Gide膜由I型和III型纯猪胶原蛋白组成，没有交联或化学添加剂，经过精制去除抗原[12］．文献中描述的降解期为8周[26]至4至6个月内[11，27］．在本研究中，在形态学分析中均观察到30天和60天细胞膜的存在，没有观察到巨细胞。这些观察证实，在60天(大约8周)，Bio-Gide®膜没有显示出降解的迹象，因此可以认为是一种缓慢降解的膜。

屏障结构由两层组成。多孔的表面与骨头接触。致密表面与软组织保持接触，以防止纤维组织生长到骨缺损[28］．在BG组，骨新形成呈岛状，结缔组织细胞较少，提示部分骨吸收和骨组织渗透。这可能是由于膜的高渗透性，允许血管生成。在30和60天，更多的缺损被闭合，并且在30天获得的骨体积似乎保持到60天修复过程结束。因此，BG组使用的膜在骨修复过程中保持了高水平的性能，这与之前的观察结果一致[11，27］．

GD和GDF组使用的膜由脱钙牛皮质骨的I型胶原组成。根据制造商的说法，GenDerm®膜厚度为150-200μ.m，比GenDerm Flex®膜薄，200-250μ.GD组显示纤维细胞结缔组织，在第30和60天仅检测到GenDerm®膜的片段，而在第60天观察到的片段较少。这些结果证实了之前报道的膜碎片[14或完全没有膜[13，1630天。

在GDF组中，骨骼新涂养更加渐进。与GD组相比，微观分析显示出较慢的吸收。在一些大鼠中，可以在60天内验证几乎完全膜的存在。在30和60天的GDF组中膜外表面上的多核巨细胞的观察表明，如前所述，该生物材料的尝试吸收，可以提高GBR的结果，并为外科医生提供其他选择来解决日常诊所中出现的困难[14］．

GD和GDF组的比较显示，前者比后者的骨新形成面积更小，这可能直接与性别m®膜比性别m Flex®膜降解更快有关。免疫组化评价显示GDF和BG组之间相似的生物学行为，这在骨桥蛋白和骨钙素标记物的比较中得到证实。

可以在具有相同组成的膜中分析膜厚度（Genderm®和GendermFlex®）。与GDF组相比，GD组的GBR结果干扰了GB组的否定，因为与较薄的膜相比，较厚的膜导致更有效的GBR过程。这可以通过GD组中的膜的早期降解来解释，其允许在缺陷内的结缔组织的生长。这抑制了骨骼新涂鸦。膜厚度对其完整性的时间维持的影响已经描述了[13］．

适用于特定临床问题的膜选择的标准是基于他们在研究其生物行为的研究中所证明的结果。植入物放置之前或在植入物植入和植入物缺陷之前或在植入物缺陷的情况下的情况需要使用膜，并且GDF组表明GendermFlex®在这些情况下可以是高度可行的选择[29］．

该研究的主要局限性之一是缺乏有关GenDerm Flex®膜使用的可用参考材料。这可能反映了它的商业化相对较晚。30天和60天的分析周期也限制了对膜的完全吸收的评估，主要是bio - gid®，在60天没有显示出吸收开始的证据。具有较长评估期的研究将是有价值的。

5.结论

这一结果支持了我们检测的Bio-Gide®、GenDerm®和GenDerm Flex®膜促进大鼠严重颅骨缺陷中的GBR的结论。阳性对照组和GDF实验组在GBR过程中表现出更好的生物学行为和更高的骨新生指数。

数据可用性

支持本研究结果的数据包含在文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者谨此感谢学校矿物化组织（LSMT）的研究实验室，unesp（Fapesp，2016 / 12053-0），用于执行免疫组化分析。

补充材料

到达指南清单。（补充材料）

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