Gelam蜂蜜和5-氟尿嘧啶对体外人腺癌结肠癌HT-29细胞的组合细胞毒性作用

摘要

使用化学药物的天然产品的组合正在成为发现新的治疗方法来增强癌症处理过程的趋势。在本研究中，我们旨在探讨Gelam蜂蜜（GH）的细胞毒性和凋亡诱导与HT-29细胞上的或没有5-氟尿嘧啶（5-FU）结合或没有5-氟尿嘧啶。通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑粒溴化物测定来测定细胞活力以评估细胞毒性。通过流式细胞术分析分别由倒置显微镜，膜蛋白V-FITC和DNA碎片测定形态变化和细胞凋亡。我们的结果表明，与GH和5-FU相比，联合治疗揭示了HT-29细胞上的显着和浓度依赖性细胞毒性作用。流式细胞术分析表明，在组合治疗中，早期的细胞凋亡事件更加明显。此外，与5-FU单独，用GH和5-FU的组合处理的HT-29细胞的细胞凋亡证明了分段DNA的百分比增加。我们的研究结果表明，GH在HT-29细胞系中具有5-FU的协同细胞毒性作用体外．虽然其作用的分子机制尚不清楚，但结果显示GH和5-FU联合使用可能具有作为治疗药物的潜力。

1.介绍

自古以来，蜂蜜已被消耗作为日常营养补充剂。其主要组成部分是碳水化合物，如葡萄糖，果糖和蔗糖。蜂蜜蜜蜂从鲜花中收集花粉，后来通过反向和蒸发将它们转化为蜂蜜。马来西亚有几种蜂蜜，如蜂蜜，柚子蜂蜜和菠萝蜂蜜。所有这些都是基于它们的主要花粉量的差异化，这可以通过花粉分析鉴定，因为花粉是特定的物种[1]．科学证明蜂蜜有几种药用特性，如抗菌剂[2那3.),抗氧化剂(4.]， 消炎（药 [5.]，antiTumour [6.]和伤口愈合能力[7.]．内部蜂蜜内的酚类化合物，如无碱酸，绿原酸，咖啡酸，p-香豆素，阿魏酸，鞣果，槲皮素，橙皮素和蛹，是蜂蜜抗炎和抗肿瘤效应的主要贡献者[6.那8.]．

在结肠直肠癌的初始处理期间，通常使用称为5-氟尿嘧啶（5-FU）的化学治疗药物。其主要机制涉及通过氟核苷酸的MISlincorations抑制胸苷合酶的功能来破坏DNA和RNA的正常功能的破坏[9.]．然而，由于酶双嘧啶脱氢酶（DPD）的肝脏降解，据报道，5-FU在细胞内的可用性低。因此，治疗过程中需要大剂量[10.]．除了对人体非常有毒的情况下，这种药物的较高剂量会对患者引起严重的副作用。过去的研究发现，将药物与蜂蜜等天然物质相结合，可以增强其对癌细胞的影响，并最大限度地减少其毒性[11.]．与5-FU相结合的GH的用法已被证明可以显着降低HCT-116细胞的生长，与单独的5-FU的治疗不同[12.]．此外，GH Plus姜提取物在Caspase-9表达的上调方面对HT-29细胞表现出协同作用[13.]．

在本研究中，使用Gelam蜂蜜，5-氟尿嘧啶及其组合来确定对HT-29细胞的细胞毒性和凋亡作用。在膜完整性，DNA分裂和细胞凋亡的早期事件方面进行了观察。这些对于建立未来治疗结直肠癌的新策略是有用的。

2。材料和方法

2.1。蜂蜜样本

本研究中使用的Gelam蜂蜜是从马来西亚的Gelam Forest，Besut，Terengganu林。通过将蜂蜜与RPMI-1640培养基混合并使用0.22-滤滤液来制备蜂蜜的储备溶液。μ.M注射器过滤器。本研究中使用的Gelam蜂蜜已被认可的实验室测试并确认是纯蜂蜜。

2.2。细胞系

人结肠直肠腺癌HT-29细胞是从美国组织培养收集（Manassas，VA，USA）获得的。细胞在RPMI-1640培养基（Sigma，St.Louis，USA）中生长，补充有10％胎牛血清（Gibco，USA）和抗生素（即100.0单位/ ml青霉素和100.0μ.g / ml链霉素）（奥地利Paa）。它们在37°C的培养箱中保持在37°C的培养箱中₂和一个潮湿的环境。将HT-29细胞每2至3天转移一次，在半核酸条件下用胰蛋白酶样酶和酚红色（Gibco，USA）处理5分钟。然后将细胞重新悬浮在用血清中的培养基中，然后转移到2或3个新烧瓶中。选择具有95％及更高的细胞活力的样品用于本研究中使用。

2.3。MTT细胞毒性测定

如Ali等人所述，在96孔板中进行MTT测定。[14.]．一个100.0.μ.将L完全生长培养基置于96个平底微量滴定板（Unclon，USA）中。这是加入100.0μ.L-29细胞的浓度为1-2×10^5.在使用前已经接种了24小时的细胞/ mL。RPMI-1640培养基中的蜂蜜样品（400mg / ml）在三份和连续稀释的孔中等来。未经处理的细胞用作对照。将板在CO中孵育72小时₂培养箱在37°C。孵育后，20.0μ.将L的MTT溶液（5.0mg / ml）加入每个孔中，进一步温育4小时。然后从孔中除去培养基和100.0μ.L中的二甲基磺氧化物（DMSO）加入到每个孔中，得到所得的甲卓血红素[15.]．在570nm下，使用板读数（Biotek，USA）在570nm下分析孔的光学密度（OD），参考630nm。随后绘制了细胞活力与样品浓度的剂量响应曲线。

2.4。吖啶橙和碘化丙啶染色（AO / PI）分析

HT-29细胞用GH，5-FU和24,48和72小时的组合处理。孵育24小时后，将细胞收获到离心管中并以300×g沉淀10分钟。通过如上所述用离心机用PBS洗涤细胞粒料。然后将颗粒悬浮在50.0中μ.L吖啶橙（10.0μ.和50.0 g / mL)μ.l碘化丙啶（10.0μ.g / ml）5分钟。一卷10.0μ.将染色细胞浸入玻璃载玻片上并用盖板覆盖。使用倒荧光显微镜（尼康TE2000-U，日本），如Ali等人所述，在超过100个细胞的群体中评分可行的，凋亡和坏死细胞。[16.]

2.5。流式细胞术磷脂酰丝氨酸外化分析

凋亡检测试剂盒（BD Annexin V-FITC）用于流式细胞术分析。含有含有荧光染料FITC，碘化丙锭和结合缓冲液的藤化蛋白。HT-29细胞（2×10^5.将细胞/ ml）用GH，5-FU处理，以及6个孔3,6和12h的组合。完成处理后，将细胞收获到5ml管中，并在摆动转子中以300×g离心10分钟。用PBS洗涤电池粒料，之后用PBS洗涤两次μ.将L的结合缓冲液加入管中。一个体积为5μ.l的Annexin V FITC和5μ.将L的PI作为染色溶液加入管中。然后将混合物在黑暗中温育15分钟。然后添加400μ.L与每个管子的结合缓冲液。在使用Cytoflex流量仪（Beckman Coulter，USA）分析之前，将管在分析之前轻轻涡旋。相应地将大约10,000个事件分类为可行，早期的凋亡，晚期凋亡和坏死细胞阶段[17.那18.]．

2.6。通过末端脱氧核苷酸转移酶DUTP碎片末端标记（TUNEL）的DNA碎片分析分析

根据制造商的协议（Becton Dickinson，USA）使用Apodirect™试剂盒进行Tunel Assay。浓度为1×10的细胞^6.将细胞/ mL用PBS（pH7.4）固定在1％（w / v）多聚甲醛上，冰上60分钟。然后将细胞以300×g离心5分钟，然后用5ml PBS洗涤两次。然后将细胞重悬于70％（v / v）冰冷的乙醇中并在-20℃下储存1周。孵育后，除去乙醇，使用洗涤缓冲液洗涤细胞两次。然后通过在50中孵育进行细胞的终点。μ.l在37℃下将DNA标记溶液（含有TDT酶和溶解在反应缓冲液中的FITC DUTP）进行60分钟。孵育后，在用0.5ml PI / RNase染色缓冲液染色之前，将细胞在1mL漂洗缓冲液中洗涤两次。在黑暗环境中进行染色过程30分钟。之后，然后使用Cytexpert软件在Cytoflex（Beckman Coulter，USA）中分析细胞。

2.7。统计分析

数值参数表示为平均值±标准误差装置（S.E.M.）。所有实验均以三份进行并使用单向分析（ANOVA）进行三次进行分析，然后用Tukey的后HOC测试进行分析。P≤0.05的置信度的值被认为是统计学意义的。

结果

3.1。Gelam蜂蜜，5-氟尿嘧啶的细胞毒性及其在HT-29细胞和正常结肠细胞中的组合

使用MTT测定检查Gelam蜂蜜对HT-29细胞进行细胞毒性。确定所得甲藻蓝的光密度，其反映了在活细胞中的线粒体脱氢酶的正常功能[15.]．GH，5-FU和它们的组合在72h处理（相对于未处理的细胞）后的毒性（相对于未处理的细胞）根据它们的各自浓度降低至50％（CD_50.）。Gelam Honey减少了CD的可行HT-29细胞的数量_50.36.2毫克/毫升。与此同时,光盘_50.5-fu是15.5μ.g / ml（图1）。从结果，CD_25.和CD₇₅5-fu是6.25μ.和227.4克/毫升μ.分别g / ml。乳糜泻组合_50.具有三种不同浓度的GH浓度（CD_25.，CD_50.和CD.₇₅5-fu减少了CD_50.GH至30.4mg / ml，分别为33.2mg / ml和2.4mg / ml（图2）。在正常的结肠细胞系，CCD-18CO上也测试了GH和5-FU的细胞毒性。CD._50.CCD-18CO细胞中GH的值为89.8mg / ml。同时CD._50.CCD-18CO细胞中的5-FU是203.1μ.g / ml（图3.）。因此，组合36.2mg / ml GH和15.5μ.选择G / mL 5-FU，因为这两个值都在CD下方_50.正常结肠细胞中GH和5-FU的值。计算组合指数以确定GH和5-FU组合的协同活动[19.]．获得的组合指数(CI)分析值小于1，说明GH与5-FU之间存在协同效应。CD._50.GH，5-FU及其组合的价值（所​​有在CD_50.浓度）用于本研究的每次随后的测定中。

3.2。用吖啶橙和碘化丙啶双染色的细胞死亡模式

进行细胞的形态学评估（使用吖啶橙和碘化丙锭）以确定CD处理治疗的HT-29细胞死亡模式_50.剂量。如图所示4.，在将GH从24小时的24小时下，在48小时的24小时下，在24小时，凋亡细胞的凋亡细胞的数量显着增加，72小时，41.03％。类似地，在阳性对照（5-FU处理的细胞）中，相应的值在24小时的24小时，22.02％在48小时，23.01％，72小时。记录了凋亡细胞的最高百分比用于组合治疗GH + 5-FU，其值为25.33％，在48小时，33.05％，72小时，46.67％。在治疗组中检测到低百分比的坏死细胞，其与未处理的基团没有显着差异。

3.3。早期凋亡事件方面的磷脂酰丝氨酸外化分析

磷脂酰丝氨酸外化是凋亡期间的早期事件，可以通过使用膜蛋白V和PI染色来评估。在这项研究中，发现在CD治疗的3小时内，在所有基团中检测到这种凋亡的早期事件_50.剂量（数字6.和7.）。对于GH治疗的标本，早期凋亡事件的百分比在3小时的3小时内为4.66％，6小时6.20％，12小时12.31％。测量的晚期事件的百分比为3小时，3小时3小时，3.85％，12小时，10.16％。在GH治疗的标本中没有检测坏死事件。为5-FU处理的标本进行了类似的测量。5-FU处理试样中早期凋亡事件的百分比随时间的推移而增加（3小时，8.11％，6小时，12小时，16.56％。然而，与GH处理的基团相比，5-FU处理的试样中的晚期凋亡事件较低的较低百分比（4.41％，在6小时，3.05％，12小时，6.79％）。与单独的GH或5-FU相比，在合并的（GH + 5-FU）处理基团中获得较高百分比的凋亡细胞。在组合治疗中，早期凋亡事件的百分比为3小时，9.37％在6小时，12小时下为18.64％。

3.4。DNA碎片分析：标志性细胞凋亡检测

DNA碎片是细胞凋亡的标志性事件之一。使用TUNEL测定法进行细胞中DNA碎片的定量评估。在24小时治疗时间后，HT-29细胞内的DNA开始在所有治疗组中进行切割（在GH治疗中的这种细胞的百分比为4.44％，5-FU处理4.21％，占71.67％GH + 5-FU治疗组合）。数字8.显示GH + 5-FU治疗组联合蛋白阳性细胞百分比的显着增加（在48小时后92.49％，72小时后94.90％）。有人指出，CD的所有治疗方法_50.剂量随着时间的推移增加了TUNEL阳性细胞的百分比。相反，在整个治疗期间，对照组记录了DNA裂解（小于0.3％）的非常低的发病率。这表明DNA裂解在健康的HT-29细胞中不是正常发生，因此表明其原因是GH和5-FU的细胞毒性。

4。讨论

在过去的几年中，癌症化学预防和治疗使用传统药物在全球上获得了大量的研究。在本研究中，研究了Gelam蜂蜜（GH）的细胞毒性和凋亡诱导与HT-29细胞上的GLAM蜂蜜（GH）联合或没有5-氟脲（5-FU）。细胞毒性结果显示，GH表现出降低HT-29细胞的活力的能力，并且在组合治疗中，与GH和5-FU相比，细胞毒剂量减少，并依赖于GH和5-FU。结果还表明GH和化学品5-FU在改变HT-29细胞生长时的协同作用，这根据Chou-talalay方法定量分析[19.]．之前的研究表明，GH中总酚类化合物含量高，这与GH的生物活性密切相关[20.]．研究还发现，蜂蜜中的酚类化合物直接有助于降低结肠癌细胞的生存能力[21.]．在正常的结肠细胞中不能看出类似的效果，表明GH活性是细胞依赖性，因此可能用作与5-FU的组合中的结肠癌治疗的替代品。5-FU是一种众所周知的药物，广泛用于结肠化学疗法。已经建立了许多策略，以改善5-FU的活性，其中一个是使用联合治疗[22.-24.]．在常见的临床实践中，5-FU与白蛋白，Irinotecan或Oxaliplatin的组合显示出该药物活性的改善[25.]但是，与5-FU相关的副作用可能会妨碍治疗癌症患者的努力[26.]．旨在突出GH可能提高5-FU活动的假设，通过Hakim等人启动的GH和5-FU的组合。透露GH可以成为潜在的候选人，以便在5-FU协同上工作[12.]．然而，发现其潜在价值的发现不足，需要获得更多的数据来揭示其益处。据我们所知，没有迄今为止的实验证据表明了Gelam蜂蜜和5-FU分别在HT-29细胞中诱导细胞凋亡。然而，对单独的Gelam Honey的生物活性进行了密集的研究。Gelam Honey是一个着名的突出物质，廉价，相对无毒，并且在市场上很容易获得。此外，亲爱的蜂蜜已经从古代以来已经使用。Gelam蜂蜜被认为是潜在的癌症治疗，具有减少可行性各种癌细胞系，如MCF-7，HCT-116，HepG2，A549和HT-29 [12.那27.-30.]．

许多体外和体内研究表明，生长激素单独具有显著的抗增殖和凋亡作用，在生长激素治疗的癌细胞中观察到[13.那27.那28.那30.那31.]．在癌细胞中，已知凋亡的诱导是癌症治疗的有效策略。细胞凋亡是一种编程的细胞死亡，其聚焦在细胞死亡领域，这些细胞死亡领域涉及内在（线粒体依赖性）或外在（死亡受体依赖性）途径[32.-34.]．在凋亡的早期发生期间，将磷脂酰丝氨酸（PS）的易位从细胞膜的内表面发生到外部细胞膜[35.那36.]．我们证实，磷脂酰丝氨酸(PS)早在HT-29细胞暴露于处理后3小时就发生了易位。有趣的是，联合处理显示PS在细胞中易位的百分比最高。尽管有报道称PS易位是可逆过程[37.[我们的形态学检查表明，与单个治疗相比，组合治疗中处理的细胞经历了越来越多的细胞数量（图5.）。这些证实HT-29细胞经历细胞凋亡，并且不可逆转。此外，我们的DNA碎裂分析结果表明，GH和5-FU的组合增加了HT-29细胞中的碎片DNA。DNA碎片是在凋亡途径中发生的晚期过程之一[38.那39.]．总的来说，这些发现进一步支持GH和5-FU的细胞毒性效应和HT-29细胞中诱导细胞凋亡的组合以时间依赖的方式。

结论

综上所述，GH和5-FU联合使用对人结直肠癌HT-29细胞的细胞毒和凋亡作用有协同作用。5-FU与GH在HT-29细胞上的协同作用，需要进一步研究HT-29细胞的潜在分子机制，重点应放在分子相互作用上，明确GH增强5-FU疗效的具体途径。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中。

利益冲突

作者宣布没有关于本文出版物的利益冲突。

致谢

作者要感谢苏丹大学苏丹·扎纳尔·阿米丁的生物资源和食品工业学院;和马来西亚大学邓腾犬大学基础科学学院;和大学伊斯兰教马来西亚为博士学位的项目和教育部的技术和财政支持。奖学金支持。

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