抽象的

我们的研究小组首先发现内皮过表达的脂多糖相关因子1（eola1，GenBank数AY074889）作为ECV304细胞中的脂多糖（LPS）反应性基因。先前的研究进一步证明了EOLA1与金属硫硫代蛋白2a（MT2A）的关联，而EOLA1在LPS诱导的ECV304细胞中炎症反应中的作用尚不清楚。在本报告中，我们确定了EOLA1的亚细胞定位以及EOLA1在ECV304细胞中响应LPS的血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）上的调节能力。我们的结果表明，EOLA1在细胞中广泛扩散，EOLA1表达被LPS巨大诱导。EOLA1敲低导致LPS诱导的VCAM-1产生的显着增强。与此相一致，EOLA1的过表达导致LPS诱导的VCAM-1产生的减少。此外，MT2A敲低减少了LPS诱导的VCAM-1产生。总体而言，我们的结果表明，EOLA1在LPS诱导的VCAM-1表达中的负调节作用，涉及其与ECV304细胞中MT2A的关联。

1.简介

内皮过表达的脂多糖相关因子1（eola1，GenBank编号074889，也称为CXORF40A）在2004年刺激了用脂多糖（LPS）刺激ECV304细胞后，我们的研究小组已经从具有差异表达的基因中鉴定出来[1，，，，2];但是，其生物学功能知之甚少。eola1is located at human chromosome Xq28 and contains 6,248 bases in genomics and 5 exons separated by 4 introns. Theeola1Gene在黑猩猩，恒河猴，狗，老鼠，老鼠，鸡，斑马鱼和青蛙中高度保守。EOLA1蛋白包含158个氨基酸，具有多个糖基化和磷酸化位点，以及无信号肽和膜跨膜结构域的螺旋 - 转移螺旋基序。这些结构特征表明EOLA1是一种细胞内蛋白，可能与细胞质和细胞核中其他未知蛋白相互作用以调节细胞功能。生物信息学分析回顾了EOLA1基因属于激活信号协调剂-1（ASC-1）同源性（ASCH）超家族，在许多生物体中经常观察到这[3，，，，4]。

eola1is weakly expressed under the steady condition and highly expressed in response to LPS in ECV304 cells. The discovery of the protein association between EOLA1 and metallothionein 2A (MT2A) has been confirmed by yeast double-hybridization and coimmunoprecipitation assay [2，，，，5]。已知MT2A具有抗炎，抗雄激素毒素和肿瘤抑制作用，对细胞培养[6，，，，7]。此外，MT2A通过诱导凋亡和G2/M停滞抑制细胞生长，这对NF-进行负调节κB pathway by upregulation of Iκb-α和p-i的下调κb-α和细胞周期蛋白D1 [8]。基于大鼠肝移植模型，我们发现Eola1表达在移植排斥中的显着变化[9]。These results suggest a possible role of EOLA1 in transmitting inflammation-related signals through association with MT2A and thus participating the regulation of inflammatory response in endothelial cells.

LPS是几乎所有革兰氏阴性细菌中存在的主要外表面膜成分，在从昆虫到人类范围内的多种真核物种中触发先天免疫反应来触发先天免疫反应的配体[10，，，，11]。The induction of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) is the hallmark of activated vascular endothelial cell [12]。VCAM-1属于免疫球蛋白超家族，调节白细胞募集和对炎症部位的免疫反应，并加速动脉粥样硬化的发展[13，，，，14]。还已知LPS至少部分通过血管内皮细胞中VCAM-1表达的上调诱导炎症免疫反应。

为了进一步了解EOLA1在调节炎症免疫反应中的生物学功能，我们专注于确定EOLA1的亚细胞分布及其在调节LPS诱导的炎症基因反应中的功效，包括ECV304细胞中的VCAM-1。

2.方法

2.1。LPS制备和细胞培养

从从中提取的纯化本地LPS苯酚E. coliserotype 0111: the B4 (Sigma) was dissolved in phosphate-buffered saline (PBS) to the dilution of 1 mg/mL and stored at −20°C. For experiments, the LPS stock solution was further diluted into supplemented tissue culture media to the working concentration of 100 ng/mL. ECV304 cells (ATCC) were cultured in Medium 199 supplemented with 10% fetal bovine serum, 3 mg/mL HEPES, 100 U/mL penicillin G, 100 mg/mL streptomycin, and 6 U/L insulin on gelatin coated dishes in a humidified atmosphere of 5% CO2。将融合培养物用EDTA-Trypsin溶液分离，并分成1：3以进行进一步使用。

2.2。EGFP-EOLA1融合蛋白表达质粒和细胞转染的构建

根据EOLA1的开放式阅读框（ORF）序列合成一对引物（正向引物：5'-Accaggatctcttcttcattcatgcccaaag-3'，反向引物：5'-agcaggatcctctttcctttcattcatgccccccccccaaag-3'）;ecor我和BAMHI endonuclease sites were introduced into the terminals of forward and reverse primers, respectively. ECV304 cells were stimulated with LPS (100 ng/mL) for 6 h, and then the total RNA was extracted for RT-PCR (TaKaRa), and finally the ORF sequence of EOLA1 was amplified. The PCR product and pEGFP-N2 plasmid (Clontech) were cut with endonucleasesecor我和BAMHI，然后通过电泳回收酶切割产物，并与DNA连接酶（Takara）联系起来，最后将目标ORF序列插入PEGFP-N2质粒中，并选择单个菌落进行测序（Takara）（takara）（takara），在合法性转化后Escherichia coliDH5α。

For cell transfection, ECV304 cells were split onto 6-well culture plate (precovered with a sterile coverslip) by 1.5 × 105/良好，不断培养。然后，使用脂质体Lipofectamine 2000（Invitrogen）将融合蛋白表达质粒PEGFP-EOLA1和对照质粒PEGFP-N2转染48小时。转染效率由GFP阳性与阴性细胞确定。

2.3。EOLA1的亚细胞分布

细胞转染48小时后，去除培养基，然后用PBS两次冲洗细胞，并用4％PFA固定。一部分细胞用于检查亚细胞位置。将细胞与大鼠抗GFP抗体（原代抗体）和山羊抗鼠抗体（二抗）孵育，用DAPI染色，并在LSM510 Meta激光共聚焦显微镜（Zeiss）下拍摄。为了在免疫电子显微镜下观察，用4％PFA固定细胞，然后用3％二氧化碳氧化并与血清孵育。用先前制备的兔抗Eola1多克隆抗体作为原代抗体和HRP标记的山羊抗兔IgG IgG抗体作为二抗体进行孵育。然后将细胞用HRP标记的链抗抗生素和二氨基苯胺（DAB）染色，用2.5％的甲状腺素（DAB）染色，并用0.1％的渗透酸固定，在梯度上用丙酮脱水，然后在70％乙酸乙酸铀乙酸酯中保存过夜，然后将其保存过夜。将细胞用纯丙酮进一步冲洗，用丙酮和环氧树脂的混合物（V：V = 1：1）浸泡，用纯嵌入培养基（无环氧树脂固化启动子DMP-30）和嵌入培养基（DMP--30）在40°C下，并嵌入环氧树脂618。最后将细胞制成超薄切片，用铅染色，并在Tecna110透射电子显微镜（Philips）下观察和拍摄。

2。4。Knockdown Experiments

使用RNA干扰（RNAI）完成了EOLA1的敲低。The oligonucleotide sequences of EOLA1 shRNA (small hairpin RNA) were as follows: sense: 5′-AGGAGGCAAGGATGTATTCTTCAAGAGAGAATACATCCTTGTTTTTTT-3′ and antisense: 5′-AATTAAAAAAAGGAGGCAAGGATGTATTCTCTCTTGAAGAATACATCCTTGCCTCCTGGCC-3′.For knockdown of MT2A, the oligonucleotide sequences of MT2A-shRNA were as follows: sense: 5′-GATCCGCCGTG ACCGTTTGCTATATTTCAAGAGAATATAGCAAACGGTCACGGTTTTTTGGAAA-3′ and antisense: 5′-AGCTTTCCAAAAAACCGTGACCGTTTGCTATATTCTCTTGAAATATAGCAAACGGTCACGGCG-3′.通过将这些寡核苷酸插入质粒PSILENCER 3.1/H1 HYGRO（AMBION）中，通过将这些寡核苷酸插入sHRNA表达盒。未加工的质粒PH1用作空白对照。根据说明手册，将细胞用PH1，PH1-EOLA1 shRNA或PH1-MT2A shRNA转染，lipofectamine 2000在无血清的Opti-Memi（Invitrogen）中转染。转染的DNA载体的浓度为8 μg/ml最终卷为500 μL. The cells were washed after 4 h incubation and resuspended in complete growth medium with serum for further experiments.

2.5。RT-PCR和VCAM-1分析

The total RNA was isolated from the cells using TRIzol reagent following the manufacturer’s instructions (Invitrogen). To measure the gene mRNA expression level, RT-PCR was performed using one-step reagent kit (TaKaRa). The primers are synthesized from commensal (EOLA1 upstream: 5′-GCTCGAATTCATGAAGTTTGGCTGCCTCTC-3′, downstream: 5′-AGCAGGATCCTCTCTTCATGCCCCAAAG-3′;β-actin：上游：5'-CGGGAAATCGTGCGTGACATT-3'，下游：5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGTGGAC-3'）。对于VCAM-1分析，将细胞在包含1％蛋白酶抑制剂的PBS（1：2，w/v）中匀浆，然后在4°C下以12,000×g离心20分钟。抗EOLA1多克隆抗体是由新西兰白兔子免疫产生的，并通过Western印迹鉴定。针对EOLA1的IgG被纯化在蛋白质A sepharose柱上。通过ELISA分析测量多克隆抗体的效率。通过用抗Eola1抗体的蛋白质印迹分析了ECV304细胞的裂解物。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒（Sigma）分析上清液。

2。6。Western Blot Analysis

将转染的细胞用补充的RIPA缓冲液裂解，含有完整的蛋白酶抑制剂片剂（Roche）。通过Lowry分析测量裂解物蛋白浓度。蛋白质样品（30 μg）在SDS-9％聚丙烯酰胺凝胶上加载，然后使用标准程序在电印迹设备中转移至硝酸纤维素膜中。如前所述进行免疫检测[2]通过使用抗EOLA1，抗MT2A或抗GFP作为原代抗体和二抗IG-Horseradish过氧化物酶结合物（Invitrogen），抗 -β-Actin作为加载控制。抗EOLA1多克隆抗体是由新西兰白兔子免疫产生的，并通过Western印迹鉴定。对EOLA1的IgG纯化在蛋白质A sepharose柱上。通过ELISA分析测量多克隆抗体的效率。

2.7。统计分析

数据表示为平均值±标准误差。学生们 进行检验以确定ELISA测定法的统计显着性； 被认为具有统计学意义。

3。结果

3.1。ECV304细胞中EOLA1的亚细胞分布

ECV304 cells were transfected with pEGFP-EOLA1 fusion protein expression plasmid and the control of pEGFP-N2 plasmid for 48 h. The images were observed under laser confocal microscope. ECV304 cells transfected with either control plasmid or fusion protein expression plasmid demonstrated uniform whole-cell distribution by green fluorescence, while the cells transfected with fusion protein expression plasmid also had nuclear aggregation (Figures1（a）和1（b））。用制备的兔抗EOLA1多克隆抗体作为原代抗体，将转染的细胞在免疫学上标记，然后在电子显微镜下观察。用对照质粒转染的细胞中没有免疫学沉淀物，但是将显着的免疫学沉淀沉积在用融合蛋白表达质粒转染的细胞的细胞质地面物质中（图图）1(c)）。

（一种）
（一种）
（b）
（b）
(c)
(c)
Figure 1
EOLA1的亚细胞位置在ECV304细胞中指示。ECV304细胞用空白质粒PEGFP-N2和融合蛋白表达质粒PEGFP-EOLA1转染。48小时培养后，转染的细胞用4％PFA固定。（a）在光学显微镜下拍摄ECV304细胞的图像。（b）将细胞与大鼠抗GFP抗体（原代抗体）和山羊抗rAT抗体（二抗）孵育，用DAPI染色，并在LSM510 Meta Laser共聚焦显微镜下拍摄。（c）将细胞与兔抗Eola1多克隆抗体（原代抗体）和HRP标记的山羊抗兔抗兔IgG IgG抗体（二抗）孵育，用HRP标记的链霉菌抗抗生素和二氨基苯甲固醇，并用Epoxy resoxy Resin 618染色。将细胞分为超薄切片，用铅染色，并在tecna110透射电子显微镜下观察和拍摄。白色箭头鉴定了通过抗EOLA1抗体转染PEGFP-EOLA1的ECV304细胞中的免疫沉积物沉积。
3.2。LPS在ECV304细胞中诱导EOLA1表达和VCAM-1产生

ECV304 cells were grown to 80% confluence and then stimulated with LPS (100 ng/mL) for a time-course as indicated. The cells showed that EOLA1 expression was increased in a time-dependent manner at both gene transcription (Figure2（一种））和翻译（图2（b））。然后通过ELISA测量澄清培养上清液中的VCAM-1浓度。细胞暴露于LPS（100 ng/mL）导致3小时后VCAM-1产生的显着增加（ ) (Figure2（c））。所有数据均通过三个独立实验重复。

（一种）
（一种）
（b）
（b）
(c)
(c)
Figure 2
LPS在ECV304细胞中诱导EOLA1和VCAM-1的产生。（A）ECV304细胞用LPS（100 ng/mL）处理不同的时间，0、3、6、12和24小时，并通过RT-PCR分析了总RNA到EOLA1。（b）通过用抗Eola1抗体的蛋白质印迹分析了ECV304细胞的裂解物。数据显示三个独立实验中的一个代表性实验。（c）在指定的时间段内用LPS（100 ng/mL）刺激ECV304细胞，并收集上清液并通过ELISA测定VCAM-1的生产。数据代表三个独立实验的平均值±SD。
3。3。Overexpression of EOLA1 Inhibited the Expression of VCAM-1 Induced by LPS in ECV304 Cells

为了进一步表征EOLA1对ECV304细胞中VCAM-1诱导的功能作用，将细胞与POPRSVI-EOLA1-EGFP和PCMV-LACI质粒共转染，以通过IPTG诱导后稳定过表达EOLA1（图）3（a））。加入IPTG 48小时后，用LPS（100 ng/mL）处理具有EOLA1过表达的细胞。LPS处理后6小时，通过ELISA分析检测到细胞上清液中的VCAM-1蛋白产生。结果表明，LPS显着诱导VCAM-1蛋白分泌，EOLA1的过表达降低了LPS在ECV304细胞中诱导的VCAM-1蛋白水平（图3（b））。

（一种）
（一种）
（b）
（b）
Figure 3
EOLA1的过表达可防止LPS诱导的ECV304细胞中的VCAM-1产生。ECV304细胞用POPRSVI-EOLA1-EGFP和PCMV-LACI质粒转染，并由IPTG诱导。（a）通过抗EOLA1抗体添加IPTG 48小时后，通过使用抗EOLA1抗体进行蛋白质印迹分析证明了EOLA1的过表达。（b）使用商业ELISA试剂盒测试了带有IPTG的诱导细胞在LPS刺激（100 ng/mL）后6小时产生VCAM-1的能力。数据代表三个独立实验的平均±SD（ ）。
3.4。敲低EOLA1增强了LPS诱导的ECV304细胞中VCAM-1的产生

为了进一步研究EOLA1对LPS诱导的VCAM-1产生的疗效，将ECV304细胞用EOLA1 shRNA转染至静音EOLA1基因。通过蛋白质印迹在EOLA1 shRNA转染的细胞中证实了EOLA1表达的显着下调。敲低EOLA1还显示了MT2A表达的降低（图4（a））。敲低EOLA1导致LPS诱导的VCAM-1蛋白分泌增强（图4（b））。

（一种）
（一种）
（b）
（b）
Figure 4
用shRNA敲低EOLA1会抑制MT2A的表达，并增加LPS诱导的ECV304细胞中VCAM-1的产生。（A）ECV304细胞用对照或EOLA1 shRNA转染48小时。用抗Eola1或抗MT2A抗体通过蛋白质印迹对细胞进行裂解和分析，β-Actin作为加载控件。（b）ECV304细胞用对照或EOLA1 shRNA转染24小时，然后用或不带有LPS（100 ng/ml）培养，并在刺激后6小时确定培养上清液中VCAM-1的浓度。数据代表三个独立实验的平均±SD（ ）。
3.5。EOLA1通过MT2A调节VCAM-1生产

EOLA1与ECV304细胞中的MT2A有关联，EOLA1调节MT2A的表达，表明EOLA1通过与MT2A关联介导VCAM-1的产生。我们进一步研究了MT2A在LPS诱导的免疫反应中的作用。MT2A敲低细胞用LPS处理，并在LPS处理后6小时通过ELISA测定法测量VCAM-1的细胞上清液。结果表明，敲低MT2A下调ECV304细胞中LPS诱导的VCAM-1蛋白分泌（图5）。

（一种）
（一种）
（b）
（b）
Figure 5
EOLA1通过MT2A介导LPS诱导的VCAM-1产生。（A）ECV304细胞用MT2A shRNA或对照shRNA转染，并用抗MT2A或ANT-EOLA1抗体通过蛋白质印迹分析细胞，并分析细胞。β-Actin作为加载控件。（b）ECV304用MT2A shRNA或对照shRNA转染，然后用LPS（100 ng/ml）刺激6小时。ELISA测定了VCAM-1的生产。数据代表三个独立实验的平均±SD（ ）。

4。讨论

eola1是我们的研究小组首先通过筛选ECV304细胞中LPS诱导的基因表达来鉴定的新基因。但是，对其在炎症中的生物学功能知之甚少。为了了解EOLA1的亚细胞分布，我们将EOLA1的ORF序列克隆到PEGFP-N2载体中，因此成功地构建了EGFP-EOLA1融合蛋白的真核表达质粒，以转染ECV304细胞。此外，我们在瞬时表达后观察到在激光共聚焦显微镜下转染的细胞。观察结果显示在细胞质和核中均具有强烈的绿色荧光信号。DAPI染色证实了融合蛋白在细胞质中表达并在细胞核中聚集。此外，我们进一步观察到EOLA1通过使用免疫电子显微镜标记技术在细胞超微结构水平上的亚细胞定位，结果证实EOLA1的表达主要定位于细胞质中。上述观察结果表明，EOLA1是一种细胞内蛋白，并且具有从细胞质中转移到细胞核中的能力，尽管这种现象仍需要在将来进一步证实。

ECV304细胞属于人脐静脉内皮细胞，可以通过LPS刺激激活。LPS已显示出启动TLR4介导的细胞内信号传导事件，包括NF-的激活κB, which ultimately leads to the transcription and release of VCAM-1 in endothelial cells to attract mononuclear macrophage accumulation for inflammatory response [15，，，，16]。最近的研究还表明，LPS诱导的VCAM-1表达有助于动脉粥样硬化过程的开始[17，，，，18]。我们的实验表明，LPS诱导EOLA1表达以及VCAM-1诱导，EOLA1的过表达可降低LPS诱导的ECV304细胞中VCAM-1的产生，而EOLA1的耗竭可显着增强LPS诱导的VCAM-1的产生。我们的结果表明，EOLA1调节LPS的内皮细胞激活程度，并可能对炎症免疫反应进行负调节。

MT2A是细胞质中一种低分子量的蛋白质，在细胞代谢中起多种作用，对抗炎和抗雄毒素具有影响，并抑制肿瘤生长。最近的报告表明，MT2A通过抑制NF-的激活来降低细胞炎症反应κB, through upregulating Iκb-α。我们的结果表明，EOLA1调节MT2A的表达，并通过与MT2A关联影响VCAM-1的产生。因此，可以避免ECV304细胞的过度激活，并且可以实现良好的调节和及时控制炎症反应。这将避免对组织和细胞过度炎症反应的损害。EOLA1与MT2A关联的详细机制及其对NF-的功能效应κB信号通路需要进一步表征。

总之，在ECV304细胞中，EOLA1在LPS诱导的VCAM-1表达中起负调节作用。

利益冲突

作者宣布他们没有竞争利益。

一种cknowledgment

这项工作得到了中国国家自然科学基金会的研究补助金（第30670838号赠款）。