文摘

痤疮是一种炎症性皮肤病;尽管一些抗炎药物治疗痤疮可在市场,他们有相当大的副作用;因此,需要新的治疗方案。在目前的研究中,16个水提取物中收集的植物在韩国济州岛用于测试抗炎活性,b . davidii显示了强烈的促炎细胞因子的表达下降造成的炎症过程c·曼秀雷敦在人类HaCaT角化细胞的细胞。b . davidii表达下调57%的cox - 2的表达,41%的进气阀打开,促炎细胞因子TNF - 29%α,32%的il - 1β,il - 6的21%,和35%的引发。此外,b . davidii抑制NF -κB和在角化细胞MAPK信号级联激活toll样受体2 (TLR-2)在回应c·曼秀雷敦。鉴于这些结果,b . davidii是一个潜在的代理来减少促炎细胞因子表达反对c·曼秀雷敦全身的炎症和可能提供一个替代当前的药物。

1。介绍

痤疮是一种慢性炎性疾病皮脂毛囊的下巴,脸颊,额头,和背部。囊肿、瘢痕疾病严重时可能发生。虽然痤疮是一种皮肤疾病,它可以导致心理问题,影响患者的生活质量。在痤疮发病机理,c·曼秀雷敦已被确定为一个主要的病原体。c·曼秀雷敦同桌的革兰氏阳性厌氧,殖民皮脂导管的毛囊,造成先天免疫反应(1]。

炎症是人体对感染的最初的复杂反应。引起的炎症过程c·曼秀雷敦开始时,肽聚糖(PGN)和lipoteichoic酸(LTA)被绑定到toll样受体(通常)激活TLR信号通路和引发重要的胞内信号通路包括增殖蛋白激酶(MAPK)和核转录因子kappa-B (NF -κB)通路。这导致核易位的转录因子,如激活蛋白1 (AP-1)和NF -κB,最终导致生产多种促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)α白介素(IL) 1β、引发和il - 6 (2,3]。

抗炎药物相关的副作用越来越常见的风险增加,包括胃肠道溃疡、出血,心脏病,肾病与非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)4]。一些抗炎药物干扰释放和hyperactivated细胞信号网络或转录因子(4]。因此,限制的不利影响,下一代的抗炎药需要目标酶或只运行在受影响的信号通路组织或炎性目标基因的一个小子集。

药用植物长期以来一直用作治疗活性化合物的来源,也是一个受欢迎的传统医学治疗炎性疾病。使用传统药物治疗炎症可以提供更安全的替代方案相比,现有的常规治疗。证据表明,中药副作用较低利率与传统药物相比,(5]。此外,药用植物用于皮肤较低或没有副作用是流行在传统医药和化妆品行业。Buddleja davidii是一种多年生草本植物,属于玄参科家族泛热带分布在南亚、非洲和美国。根、叶和花在民间药物用于抗氧化、抗炎、抗病毒、antiplasmodium和抗真菌效果(6,7]。

本研究的目的是确定的抗炎活性b . davidiic·曼秀雷敦感染并阐明其作用机理在人类角化细胞细胞系。

2。材料和方法

2.1。制备的细菌

c·曼秀雷敦(CCARM9009)购买抗菌素耐药性细菌的菌种保藏(CCARM)在韩国首尔女子大学。c·曼秀雷敦是生长在钢筋梭菌的培养基(RCM)琼脂(Becton, Dickinson和公司、美国)48 - 72小时在厌氧条件下37°C GasPak™EZ厌氧容器系统(Becton, Dickinson和公司、美国)。c·曼秀雷敦在RCM肉汤培养在80°C 100莫伊然后heat-killed 30分钟前在进一步的实验中使用(2]。

2.2。植物材料和提取

候选人植物、中草药的抗炎特性,得到在韩国济州岛。植物与蒸馏水清洗,然后使用冷冻干燥机干燥(iLShin、韩国)。干燥后,300克干草药提取三次与回流3升蒸馏水为8小时80°C。500毫升提取集中在50°C减压下使用一个旋转蒸发器(EYELA、日本)连接到一个冷藏浴循环器(Jeio科技、韩国)8]。汤是用棉布过滤其次是绘画纸(美国通用电气医疗集团)1级滤纸,冻干使用冷冻干燥机(iLShin、韩国),并将其存储在4°C进一步使用(9]。准备实验的样本,提取粉(10毫克)的股票是溶解在1毫升的二甲亚砜(DMSO)。

2.3。细胞培养

角质化细胞是人类HaCaT [10)是生长在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清和100 U /毫升青霉素在37°C湿润孵化器有限公司5%以下2

2.4。定量实时聚合酶链反应

HaCaT细胞(播种密度5×105每口井six-well板)孵化24小时,使用各种浓度(12.5,25、50和100μg / ml)水提物的植物1小时,随后heat-killed对待c·曼秀雷敦(100莫伊,5×107CFU / 24小时)。HaCaT细胞总RNA分离使用试剂盒试剂(美国生活技术,热费希尔科学)根据制造商的协议。逆转录酶(NanoHelix、韩国)反应制备使用1μg的RNA获得的互补。互补是用作实时PCR模板(存在)进行QGreen2 x SybrGreen qPCR大师混合(CellSafe、韩国)。引物序列用于检测TLR-2,进气阀打开,cox - 2, TNF -α引发,il - 6、il - 1β,GAPDH是列在表中1。GAPDH是作为内生控制。δ的Cq公式用于计算基因表达。

2.5。免疫印迹分析

HaCaT细胞治疗b . davidii水提物和heat-killedc·曼秀雷敦如上所述。然后细胞细胞溶解使用radioimmunoprecipitation分析缓冲区(里帕)裂解缓冲区包含150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 0.5%钠脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS), 50毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值8.0),液和完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(以下、韩国)。蛋白质浓度测定的布拉德福德(美国Sigma-Aldrich)测定使用牛血清白蛋白作为标准和检测使用UVITEC成像系统(英国UVITEC有限公司)。蛋白质样品(50μg)是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。5%脱脂牛奶的膜被封锁TBST缓冲区(20毫米Tris-HCl、150毫米氯化钠和0.1%渐变20,pH值7.6)1小时在室温和随后与初级抗体包括p-NF——孵化κB / NF -κB (sc-101752/8242S), p-p38 / p38 (sc - 17852 / sc - 535), p-JNK /物(sc - 6254 / sc - 7345)和GAPDH (sc - 25778)(美国圣克鲁斯生物技术公司和细胞信号技术,公司,美国)在一夜之间在4°C。膜被动摇与二次抗体室温1小时。使用ECL试剂和检测到的信号得到UVITEC成像系统设备。的相对蛋白表达p-NF -κB和NF -κB, p-p-38和p - 38, p-JNK和物(相对于GAPDH)使用ImageJ免疫印迹数据确定。

2.6。细胞生存能力分析

5-dimethylthiazol-2-yl MTT (3 - (4) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)分析了决定细胞生存能力(3]。HaCaT细胞被播种密度的104每100人μl培养基在96 -孔板。b . davidii水提物添加不同浓度的稀释系列从100年μ50 g / ml,μg / ml, 25岁μ12.5 g / ml,μ6.25 g / ml,μ3.125 g / ml,μ1.5625 g / ml,μ克/毫升。孵化24小时后,这些细胞被孵化肝癌和0.1%的解决方案在细胞培养基为4小时37°C下湿润孵化器有限公司5%2。MTT的解决方案是丢弃,DMSO溶液添加到溶解MTT-formazan晶体产生的活细胞。在黑暗中孵化2小时后,吸光度测量在540纳米16]。

2.7。统计分析

所有数据提出了均值±标准差(SD)的至少三个独立的实验,分析了用单向方差分析。学生的t测试时使用的只有两组进行比较。被认为具有统计显著性差异 ,

3所示。结果

3.1。筛查潜在的植物水提物的抗炎活性

植物水提物的效应基因的表达在桌子上2

炎症过程增加cox - 2的表达,没有合酶,产生炎症介质(12,17]。此外,促炎细胞因子如TNF -α,il - 1β、il - 6和引发触发并迅速放大炎症反应限制了传播的感染2,18]。在这项研究中,16个植物提取济州岛(韩国),检测其抗炎活性c·曼秀雷敦全身的炎症。表中描述基因表达的百分比2计算是基于基因表达的比例c·曼秀雷敦来华HaCaT细胞处理水植物提取物在没有植物水提物作为增加100%c·曼秀雷敦无HaCaT细胞。减少值代表的抑制cox - 2的表达,不,和促炎细胞因子如TNF -α,il - 1β、il - 6和引发。表2显示答:粳稻答:灰色,b . davidii,即verum,p . fibrosa水提物减少炎症过程引起的c·曼秀雷敦。其中,b . davidii水提物表现出最强的抑制引起的炎症过程c·曼秀雷敦通过减少伊诺,cox - 2, TNF -α,il - 1β(表、il - 6和引发表达式2)。

3.2。抑制c acnes-Induced TLR-2表达HaCaT细胞b davidii水提物

c·曼秀雷敦导致痤疮通过激活的炎症toll样受体(通常),特别是TLR-2 [2,19]。在最初的检查,b . davidii水提取物显示强烈的促炎细胞因子表达的下降c·曼秀雷敦对待HaCaT细胞(表2)。的影响b . davidii水提物的表达模式识别受体TLR-2显示c·曼秀雷敦诱导的表达TLR-2而接受50μ克/毫升b . davidii水提取物和TLR-2 mRNA表达减少了30%c·曼秀雷敦对待HaCaT细胞没有b . davidii水提物(图1)。

3.3。在c . b . davidii水提物减少NF-kB磷酸化acnes-Treated HaCaT细胞

TLR-2信号导致的激活NF -κB通路,然后NF -κB释放,把核调节一系列基因的表达,进而刺激释放促炎细胞因子il - 1等β,il - 6、引发和TNF -α(2- - - - - -4]。NF -κB通路被激活c·曼秀雷敦因的表达升高toll样受体2 (TLR-2)(图1)相比,c·曼秀雷敦无。b . davidii水提物剂量依赖性降低p-NF——的数量κB和NF -κB蛋白的减少可能是由于基因表达,用免疫印迹(图确定2)。这些结果表明,抗炎活性b . davidii水提物在HaCaT细胞c·曼秀雷敦全身炎症反应可能是由于抑制NF -κB信号通路。

3.4。抑制c acnes-Induced p38和物表达和磷酸化b advidii水提物

增殖作用的蛋白激酶(MAPK)信号通路发挥重要作用在调节生产多种炎症介质(2,4,20.]。的影响b . davidii水提物对c·曼秀雷敦全身的MAPK途径活性检测使用西方墨点法p-JNK和p-p38(图3)。c·曼秀雷敦全身HaCaT细胞MAPK活性和治疗b . davidii水提物提取剂量依赖性抑制MAPK活性。这些结果表明,b . davidii水提物对其抗炎行动通过MAPK信号通路的抑制。

3.5。b . davidii水提物抑制了c . acnes-Induced促炎细胞因子Expression-Induced HaCaT细胞

主要的促炎细胞因子il - 1β,il - 6、引发和TNF -α扮演重要角色在炎症(4,18]。评估的影响b . davidii水提物对c·曼秀雷敦全身的促炎细胞因子表达,HaCaT细胞使用表示浓度(12.5,25、50和100μg / ml)b . davidii水提物添加heat-killed前1小时c·曼秀雷敦莫伊(100)24小时。c·曼秀雷敦对待HaCaT增加il - 1的表达β,il - 6、引发和TNF -α。然而,il - 1的表达β,il - 6、引发和TNF -α是剂量依赖性下降c·曼秀雷敦治疗后治疗细胞b . davidii水提物(图4)。il - 1β,il - 6、引发和TNF -α表达式是下降了大约32%,21%,35%,29%,50μg / ml,分别,而未经处理的细胞。因此,50μ克/毫升b . davidii水提物的最高浓度提取显示了最大的效果。这些结果表明,b . davidii水提物可能通过抑制促炎细胞因子表达抗炎作用。

3.6。细胞毒性的b davidii水提物在HaCaT C

确定的细胞毒性效应b . davidii水提取物对HaCaT细胞,MTT试验使用。细胞治疗b . davidii水提取物浓度从0.39 24小时μ克/毫升到100μg / ml,b . davidii水提取物无明显的细胞毒性影响HaCaT细胞(图5)。

4所示。讨论

炎症被认为是一个关键因素参与寻常痤疮的发展和恶化,虽然寻常痤疮的确切发病机制尚未阐明。它已被证实c·曼秀雷敦发挥重要作用的发展炎性痤疮病变(1,4]。c·曼秀雷敦促进TLR-2在角质细胞的激活,加重炎症反应(2,4]。事实上,c·曼秀雷敦感染开始激活单核TLR-2,主要信号通路激活诱导的NF -κB或MAPKs信号通路,进而产生的细胞因子的表达,趋化因子、粘附分子,粒细胞生成因素(4,18,20.]。在这些信息的基础上,b . davidii水提物有效地防止炎症引起的c·曼秀雷敦通过抑制TLR-2 NF -κB在角化细胞信号级联(数字12)。

最近,它研究MAPK信号通路中起关键作用的监管诱导的炎症反应和协调许多基因编码炎症介质(13,19,20.]。b . davidii水提物抑制增殖作用蛋白激酶(MAPK)通过抑制p-p38和p-JNK HaCaT细胞治疗c·曼秀雷敦(图3)。TLR-2-mediated下游MAPK信号通路的激活炎性细胞因子的生产负责。MAPK激活被发现在临床痤疮病变,表明抑制MAPK信号一般对寻常痤疮的发病机制很重要(4,20.]。MAPK抑制剂的使用正在成为一个有吸引力的替代抗炎药,因为他们减少促炎细胞因子的合成20.]。这项研究的结果表明b . davidii水提物调节促炎细胞因子(TNF的表达α,il - 1β、il - 6和引发)炎症过程的抑制NF -κB和MAPK激酶通路(数字46)。因此,b . davidii水提物可能是一个潜在的MAPK抑制剂治疗细菌感染引起的炎症。

在此之前,r . coreanus,美国mukorossi,p .胶水提物的报道是抗炎(21- - - - - -23];然而,在这项研究中,r . coreanus,美国mukorossi,p .胶水提物(表没有表现出他们的抗炎活动2)。此外,答:粳稻答:灰色,b . davidii,即verum,p . fibrosa水提物表现出抑制潜在的炎症引起的c·曼秀雷敦(表2)。在这里,b . davidii水提物表现出更强的抑制引起的炎症过程c·曼秀雷敦即verum据报道在以前的研究(15),答:粳稻答:灰色,p . fibrosa(表2)。

b . davidii是一个著名的、传统草药和有前途的候选人治疗痤疮和其他炎症性疾病(6,7]。更好的理解的机制b . davidii的抗炎活动不仅会提供洞察炎症体内平衡,也为发现新的抗炎化合物提供机会在未来用更少的副作用。

总之,这项研究提供了第一手的证据b . davidii有抗炎属性通过两个途径抑制NF -κB和MAPK激酶,从而减少促炎细胞因子的表达。这些发现表明,b . davidii是一个潜在的有效的治疗寻常痤疮治疗剂。然而,进一步的研究需要一个完整的理解的作用机理以及活性成分的鉴定b . davidii木樨草素等抗炎活动、quercentin hesperetin,秋水仙碱(6,24]。此外,体内的影响的评估b . davidii需要在临床应用中使用。

数据可用性

没有数据被用来支持本研究。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究由GRRC京畿道计划(GRRC-Kyung庆熙2018(当)),韩国。