真菌壳聚糖纳米颗粒负载蜂毒的有效抗癌潜力

抽象的

壳聚糖及其纳米粒子(NPs)可以从许多真菌中提取，并用作生物活性化合物的有效载体。创新性地获得了真菌壳聚糖(FC)Fusarium oxysporum种植菌丝体，其特征和用于NP合成和用蜂毒液（BV）的装载。纳米Fc（NFC）具有192.4nm平均NP直径，38.22％的负载能力，夹紧效率为92.42％。来自NFC的BV释放是pH和时间依赖;在前6小时检测到Burst BV释放，然后逐渐发布高达30小时。这在体外NFC、BV和NFC/BV纳米偶联物对HeLa宫颈癌的抗癌潜力评估显示，它们都具有强大的剂量依赖的抗癌活性;BV/NFC纳米偶联物是最有效的 。用BV/NFC纳米偶联物、DAPI和吖啶橙/碘化丙啶组合对HeLa细胞进行荧光染色，显示早期凋亡、继发性凋亡和继发性坏死标志物的出现，并随暴露时间延长而增加。NFC的生产从病圃他们用BV的装载是强烈的咨询，用于生产有效的天然抗肿瘤剂，其增强活性对宫颈癌进行增强活性。

1.介绍

壳聚糖（CTS），衍生自脱乙酰甲基的令人震惊的氨基多糖，具有许多实际优点（例如，其生物降解性，无毒，生物相容性和有效的生物活性）[1］.Cts的生物活性鼓励其在生物医学领域的频繁应用(例如，药物递送、组织工程、抗癌治疗、抗菌制剂和伤口愈合敷料)[2］.Cts中胺基的电荷和含量是决定其生物活性形态(如载药、黏附、抗菌、药物释放控制等)的关键。原位凝胶化和渗透增强)[3.，促进了其作为药物载体和增强剂的广泛应用。Cts有望从众多真菌物种的生物量中提取出来[4.-9.];提取的真菌壳聚糖(FC)具有与常用的商业壳聚糖相当或优越的生物活性属性。

蜂毒(BV)是蜜蜂(Apis mellifera)。BV含有多种生物活性肽，可以保护蜜蜂群体免受多种捕食者和入侵者的侵害。BV中所含的生物活性成分包括蜂毒素(BV的主要成分)、阿多拉平、阿帕明、脱颗粒肽(肥大细胞)、酶(透明质酸酶和磷脂酶A2)以及一些非肽成分(如多巴胺、组胺、去甲肾上腺素)[10那11］.

BV或其成分(如蜂毒素)作为潜在的治疗和肿瘤类型的抑制剂被广泛研究;他们展示了多种潜在的分子抗癌机制[11-13］.记录了许多研究和评论，以核实BV或甜瓜对各种肿瘤类型的抗癌能力[14-18];他们得出结论，BV与其成分具有令人愉快的抗癌和细胞毒性药物，具有更广泛的多种肿瘤细胞类型。

纳米技术在大多数生物医学领域的应用变得非常普遍，包括纳米材料本身作为抗菌、抗癌、抗病毒和杀生物剂的应用，或它们与生物活性药物/化合物的负载，以增加其溶解性、稳定性、功能，并向人体输送[19］.纳米聚合物，特别是纳米CTS和纳米Fc（此后缩写为NFC），来自最评价的纳米材料，用于其生物活性和功能作为药物载体，生物保护剂和抗微生物，抗癌剂和基因递送剂，单独或与其他组成活性化合物[3.那20.-23］.

Cts纳米颗粒被有效地用作不同动物毒液(包括蛇、蝎子和BV)的载体和增强剂，用于评估它们作为抗癌剂的作用[24-28］.

因此，目前的研究针对NFC的生产，其用BV的加载，以及它们的地理解和生物活性的评估，以抑制子宫颈腺癌（HELA）细胞并阐明其作为抗癌剂的潜在作用。

2.材料和方法

２.１.真菌壳聚糖(FC)提取

真菌文化，Fusarium oxysporumF。sp。Medicaginis.， ATCC®52169™(其后缩写为流分布），在此用于Fc生产。采用马铃薯葡萄糖（PDB和PDA，Difco实验室，火花，MD）的肉汤和琼脂培养基流分布培养繁殖与维护。在搅拌的好氧条件下，在28℃下，PDB中的真菌孵育7天。根据Tayel等人完成Fc提取。[6.］.简单地说,种植后,流分布菌丝经过滤收获，去离子水(DW)洗涤，45℃风箱干燥。干流分布菌丝被脱蛋白(使用1 M的氢氧化钠)，脱矿(使用1 M的醋酸)，脱乙酰(58%) NaOH溶液110°C for 90 min);每一步后重复过滤和广泛的DW洗涤。FC脱乙酰度(DDA)由FTIR(傅里叶变换红外光谱)光谱测定，采用Baxter等人的公式[29]： 而FC分子量(MW)是通过色谱(附在折射率检测器的凝胶渗透(Postnova, Eresing，德国))测定的。

２.２.蜂毒负载纳米真菌壳聚糖的合成

纳米颗粒(NPs)的合成和BV负载依赖于以前的方法修饰[20.那24，使用合并技术。简单地说，将FC (2.0 mg/mL，稀释乙酸溶液)、TPP(三聚磷酸钠，1.0 mg/mL DW)和BV (1.0 mg/mL DW)配制成原液。TPP解决方案每分钟就被放弃(以350英镑的速度)μl / min）剧烈搅拌Fc溶液，直至最终比例 。TPP滴加后继续搅拌60分钟，并将得到的含有Nanofang壳聚糖（NFC）的照明悬浮液离心 那用DW，最近似的和冻干洗涤。对于BV负载的NFC，首先将BV加入到Fc溶液中（具有500的BV浓度 μg/mL)，搅拌30 min，再应用TPP溶液及上述步骤。

2.3。合成NPS的特征

2.3.1。红外光谱分光光度法

FTIR (PerkinElmer™FTIR V. 10.03.08, Germany)在波长为450-4000 cm时测量了FC、NFC、BV和BV/NFC纳米复合材料的光谱^-1。将粉状样品与KBR合并（以1％的比例合并， ），并绘制了它们的红外光谱。

2.3.2。NP Phyognomogmic分析

使用Zetasizer (Malvern Instruments, UK)，基于DLS(动态光散射)技术，测量了NFC和BV/NFC纳米共轭物的NP尺寸范围、平均值、中值、分布(多分散指数(PDI))和电荷(zeta电位)。此外，通过电子显微镜(透射)成像(TEM, Leica™Leo0430, Cambridge Ltd, UK)筛选合成的BV/NFC纳米共轭物的形状、分布和尺寸;将透射电镜碳包覆网格装入NP溶液和1%醋酸铀酰，风干后装入透射电镜进行检测。

2.4。评估BV封装和释放

2.4.1。蛋白质的测定

基于“Bradford方法”，用于蛋白质的标准化测定试剂盒（Pierce™Coomassie，Thermo Scientific-Pierce，Rockford，IL），用于测定NP溶液中的游离BV浓度。来自BV缀合的形成颜色在595nm吸收下分光光度测量。BSA（牛血清白蛋白）用作可比标准蛋白质。

2.4.2。装载和封装效率测量

指定的金额(10μg)将bv负载的NFC在离心管中通过强烈的旋涡将其溶解在DW中，然后离心至 10°C保存35分钟。BV的负载能力(LC)和封装效率(EE)计算如下[20.]：

2.4.3。体外BV释放

为进行BV释放检测，离心后将BV/NFC-NPs转移到离心管中，用3 mL醋酸缓冲液(pH 5.2)或磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.1)清洗。管子被维持在 那和100 μL样品每隔2 h采集30 h;然后用分光光度法测定各样品的蛋白质含量。

释放的BV蛋白量( ）特定时间（ ）的计算方法如下[20.]： 在哪里是在释放溶液中的BV浓度 那 是总释放溶液体积，和为样品体积。

2.5。NP抗癌活动

2.5.1。细胞系文化

使用从EGY-NCI(埃及开罗国家癌症研究所)获得的人宫颈癌细胞系(HeLa)。HeLa细胞在EMEM培养基中培养(添加10% ( ）胎牛血清，2.0 mm l-glutamine，0.1 mm非氨基酸，1.5克/升Nahco_3.和1.0mm丙酮酸钠）在加湿空气中进行，5％CO₂在37°C。

2.5.2。NP抗增殖活动评价

采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化铵)还原法评估BV/NFC-NPs的抗增殖活性[30.］.在一个96孔的聚苯乙烯板中，每个孔包含100μL来自完全培养基，肿瘤细胞( ）接种，在含5% CO₂在37°C。细胞粘附后，孔中逐渐吸收NFC、BV和BV/NFC- nps，溶解在DW中，浓度范围为0-500μg/mL。再孵育24 h后，加入新鲜培养基替换处理液和10μ还孵育了MTT溶液（5mg / mL的没有酚红色和血清的培养基），进一步温育3小时，直至出现紫色甲卓甲烷。在上清液丢弃后，将甲烷晶体溶解100 μL的DMSO，在540 nm吸光度1 h内鉴定颜色。纯DMSO作为对照。

将细胞活力（％）计算为 。

2.5.3。吖啶橙/碘化丙啶联合染色评价HeLa细胞凋亡

用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)联合染色评价BV/NFC纳米偶联物处理后HeLa细胞的潜在凋亡[31］.海拉细胞悬液( 细胞/mL)， BV/NFC-NPs处理500μg/mL，在5% CO的湿空气中孵育24、48 h₂在37°C。使用PBS冲洗处理和对照细胞，然后用AO（10mg / ml）和黑色（4mg / ml）在染色15分钟。根据凋亡指示剂，即绿色，橙色和红染色细胞/细胞器，在染色后25分钟内捕获图像（使用荧光显微镜奥林巴斯BX51，东京，日本）。

2.5.4。DAPI染色评价细胞凋亡

使用核染料DAPI进一步分析BV/ nfc - nps诱导的细胞凋亡(4 那6-二氨基-2-苯基吲哚)荧光染色检测处理细胞的核酸DNA片段和凝聚[32］.处理后的HeLa细胞按本节所述处理2.5.3;然后，在PBS洗涤后，用多聚甲醛（4％）固定在多聚甲醛（4％）中，用缓冲液（含有0.5％Triton X-100和3％多聚甲醛）渗透，然后50 μL的DAPI (1μg/mL)，静置60 min。荧光显微照片显示DAPI荧光染料染色的游离和浓缩细胞核碎片。

3.结果

FC的提取和生产，从流分布成年菌丝体，在这项工作中得到了收益;Fc生产率为2.41克/升发酵培养基。所生产的Fc的分子量为51.6kda和dda，88.4％。

利用FTIR分析了离子凝胶法将FC转化为NFC并加载BV的工艺效果，揭示了它们的生化结合和相互作用。

Fc，NFC，BV和NFC / BV纳米缀合物的FTIR光谱显示在图中1。在频谱中f提取的FC（图1，Fc），强峰左右约3452厘米^-1对应于氢键结合和O-H拉伸;N-H伸长(来自伯胺)在这个区域重叠。在1718 cm处检测到FC的特定吸收峰和谱带^-1(羰基(C=O)拉伸二级酰胺I带)，峰值在1539 cm^-1和1324厘米^-1（指定酰胺II（N-H）弯曲振动和分别吸收酰胺III），并在1079厘米处^-1(属于C-O-C拉伸)。NFC的频谱(图1(NFC)表示与FC光谱有一定差异;峰值为3452厘米^-1在FC中，相对强度增大，在NFC中变宽，说明氢键增强。NFC光谱在1174 cm-1处也有一个尖锐的P=O峰，表明与TPP存在交联。一般情况下，FC光谱的主要特征峰和波段出现在NFC光谱中，但它们向相近的波数有轻微的移动。

对于BV光谱，在3250-3450 cm的吸收区观测到的峰^-1表示N-H伸缩的自由振动。BV的傅里叶变换红外光谱也显示了其特征的酰胺波段，即酰胺I (1651 cm)^-1)，酰胺II(1532厘米^-1)，以及1112厘米处的条带^-1和1040厘米^-1表示不系统的线圈构象（图1，bv）。在NFC / BV纳米缀合物的FTIR光谱中，在3318cm处拉伸N-H的BV吸光峰^-1减少并转移到3421厘米^-1（数字1、NFC / BV)。酰胺I表示BV在1651厘米处的条带^-1也被转移到更高的波数（1654厘米^-1)在BV / NFC。

由FC和BV合成的NP的特征属性如表所示1。

NFC具有比BV / NFC纳米复合材料的较小平均（平均值）粒径，中值直径和尺寸范围。对于合成的NPS（对于BV / NFC纳米复合材料为0.414，对于NFC和0.414的0.262，PDI值<0.5，表示匹配和有利的NP尺寸分布（表1）.两个NP类型都有阳性Z潜力;BV加载到NFC略微将它们的阳性从+ 33.7（用于NFC）略微降低至+ 27.2（用于BV / NFC纳米复合材料）。

通过TEM成像进一步阐明了BV/NFC纳米复合材料的颗粒形状、大小和分布(图)2）.纳米缀合物颗粒主要出现球形形状和光滑的表面，分布均匀，尺寸范围为〜168-256 nm（图2）.

NFC中BV的LC和EE分别为38.22和92.42%。NFC的BV释放为在体外通过在30小时内直接分散在pH 5.2和7.0时评估。来自NFC的BV释放模式绘制在图中3.。

BV释放呈pH和时间依赖性;pH 7.1时BV的释放百分比低于pH 5.2时。释放模式为BV在前6 h爆发释放;在此之后，随着实验延长30 h，检测逐渐释放。6 h后BV释放率分别为67.2和71.4%，pH 7.1和5.2时释放率最高，分别为76.2和81.3%。

NFC、BV和FC/BV- nps的抗癌潜力，在暴露于不同浓度的合成剂后，以HeLa细胞活力的下降来测量，如图所示4.。整个药剂对检查细胞有强抗抗癌活性;所有药剂的活动都是剂量依赖性的。最有力的代理是NFC / BV纳米缀合物，然后是BV，最后是NFC。24小时后暴露于500的浓度 μ在用NFC / BV-NPS和BV处理后，只有8.3和22.3％的细胞仍然可行。200. μg/mL浓度的NFC/BV-NPs可在24 h后杀死50%的癌细胞(图)4.）.

荧光成像用于阐明NFC/BV复合物对检测的癌细胞的细胞毒性作用(图)5.）.NFC/BV纳米偶联物(500μg/mL浓度)，DAPI染色(图5.DAPI)。纳米偶联物在治疗后的HeLa细胞中诱导了可见的形态学凋亡迹象，如膜起泡、细胞收缩和圆缩。

随着暴露时间从24小时延长到48小时，大多数接受治疗的癌细胞的凋亡迹象大大增加，变得更加活跃。对照组细胞无凋亡迹象，而dapi染色的细胞有许多明亮的荧光片段/细胞核;DNA缩合和细胞凋亡迹象显著增加，且呈时间依赖性。

AO/PI双荧光染色进一步阐明细胞凋亡和坏死(图)5.，ao / pi）;可行的癌细胞出现完整的细胞和细胞核的结构和绿色。早期的细胞凋亡标志包括染色质缩合和亮绿色染色核的外观，其在24小时后清楚地出现在NFC / BV纳米缀合物的治疗后。在治疗48小时后，在HeLa细胞中显然出现了次要坏死和晚期细胞凋亡症状，具有更多染色质缩合，致密橙色染色区域，以及许多染色核，具有深度红橙色。

4.讨论

成功的成功开始了流分布菌丝，证实了研究表明真菌作为壳聚糖生产可持续来源的高潜力[4.-9.那22那23];这些调查建议从许多真菌物种中应用FC，在生物医学和健康相关领域。

FTIR分析证实其结构/组与标准常规壳聚糖相似[6.那33］.

FC谱中许多特征峰和频带向近FC谱中接近波数的轻微移动验证了NFC交联和目标NPs合成的成功[22］.NFC和NFC/BV光谱在大部分生化基团和波数强度上均接近;这表明BV并未在化学上影响或改变NFC结构，并因此维持其在人体中使用的生物安全性[29］.在NFC/BV纳米共轭物的FTIR光谱中，C-O(来自NFC)的拉伸和展宽、N-H(来自BV)的拉伸强度的降低以及它们向更小的波数的移动表明了BV和NFC活性基团之间形成了氢键[34］.

所获得的来自“Zetasizer”的关于合成的NFC和BV / NFC纳米缀合物的数据显示，BV / NFC纳米颗粒的尺寸大于NFC颗粒;这可以可以想象是由于纳米分子毒液毒液后添加的分子量和复合结构[27，验证了当前NFC承载BV能力的提升。考虑到“最小的颗粒可以到达身体的任何部位”，对于成功的生物医学应用，功能性纳米复合材料大多是在20至300纳米的NP尺寸范围内制造的[35］.

NFC在实验前6 h释放BV速度较快;这种突发释放应该依赖于BV从NFC表面的解离，正如通常报道的纳米壳聚糖上负载的蛋白质分子[21那36］.此外，蛋白质分子从纳米颗粒表面的早期快速释放和扩散被认为是不可否认的[37］.随后，BV的缓慢释放似乎归因于NFC中捕获的蛋白质分子的缓慢降解和纳米颗粒本身的降解[38］.延长释放期后，蛋白质的降解速率应超过其释放速率[39］.另外，据报道，BV以非均匀的方式将纳米纳沙的长链与非均匀的方式接合，从而在早期释放期间可以容易地释放高百分比[28］.

pH 5.2时BV的释放量高于pH 7.1时，这可能是由于壳聚糖在弱酸性溶液中的溶解度高于中性溶液;pH为5.2的条件下，NFC溶解后BV释放量增加。

荧光染色证实BV/NFC纳米偶联物诱导HeLa细胞凋亡/坏死。BV/NFC纳米偶联物的致死作用主要是由于BV的抗癌潜力，而这种抗癌潜力在NFC负载后得到加强。NFC的多阳离子特性表明，BV与细胞表面的接触更多，有利于粒子附着在肿瘤细胞上。

特别是BV的动物毒液肽具有巨大的潜力，其潜入生物制药中，可以通过与CTS这样的聚合物纳米载体的缀合来克服许多限制，以增加其化学不稳定，半衰期，口服吸收和靶细胞毒性[40］.

虽然所生产的生物活性剂(NFC和BV)是从真菌和昆虫源中提取的，但由于Cts和NFC大多是通过严酷的步骤提取的多糖(例如，非常高的碱度和温度)，因此预计这些生物的其他生物成分不会转移到人体。从而消除任何蛋白质残留物，而BV则从蜜蜂的毒素腺中获得，古代用于治疗各种疾病，在这些治疗过程中没有证据表明遗传可转移[13］.纳米族种类被证明对药物样分子的施用非常适合;聚合物纳米载体可以增强药物的半衰期循环及其沉积到患病位点，以减少到健康/正常组织的外渗[41］.

BV抗肿瘤活性主要依赖于其活性成分与癌细胞之间的密切接触，这对细胞凋亡/坏死至关重要[42］.Melittin（BV的主要蛋白质成分）被证实癌症治疗作为有效的生物活性剂[43];Melittin的主要建议功能涉及细胞膜扰动（导致溶血性和抗微生物后果）和这些膜中剧烈的结构改变的诱导（包括孔形成，混血率和融合）[44］.此外，鉴定甜瓜诱导肿瘤细胞周期，抑制它们的生长，抑制不同肿瘤细胞的细胞凋亡症状[12］.有趣的是，BV melittin被证明能特异性追踪Ras致癌基因含量极高的细胞，即肿瘤细胞[45］.

细胞凋亡被任命为BV抗癌动作的关键功能，因为死亡受体（DR）刺激和核生长因子家庭Kappa B（NF-）的刺激和失活的后果（NF-κb）癌细胞[11］.

AO / PI双荧光染色的应用，用于量化BV / NFC纳米缀合物对HeLa细胞的凋亡和坏死后果，证明了其适用性和效率。图说明了绿色，橙子和红橙色的细胞染色的变化，作为早期细胞凋亡，晚期凋亡和二次坏死的指标分别进行了说明[31］.肿瘤细胞死亡指标（凋亡，坏死和裂解）被称为潜在的机制，BV可以抑制肿瘤发育[17］.先前的研究[46提示BV对V79细胞的抗肿瘤活性强于对HeLa细胞的抗肿瘤活性;它对两种细胞的作用都是剂量依赖的。BV在在活的有机体内解决了癌症生长和增殖的抑制，以涉及淋巴结的免疫反应刺激[42］.

有趣的是，BV被说明以诱导白血病细胞凋亡，在骨髓的正常细胞上没有细胞毒性[15];BV诱导的白血病细胞凋亡的主要调节剂是通过抑制丝裂引起的信号传导路径的Caspase-3和Bcl-2 [14］.之前的流式细胞分析表明BV能够诱导ROS(活性氧)的产生，增加细胞质Ca^２＋等级，释放细胞色素C由于线粒体膜的潜力降低，促进了Caspase-3激活，因此导致细胞凋亡[16］.

提出了碳水化合物/胺对癌细胞膜的BV结合位点的量，以解释癌症类型对BV部件的不同敏感性[46];因此，我们推测，在NFC上负载BV可以在HeLa细胞膜上产生更多的结合位点，从而增强BV对这些细胞的抗增殖作用。

NP安全评估的现代方法建议使用体外/前体内模型作为其翻译的基本先决条件[47］.根据设计的安全(SbD)概念用于评估纳米材料和纳米聚合物对环境和人类健康的潜在后果及其用于开发纳米药物的用途;根据最新的SbD标准，NFC可以被认为是一种理想的安全的“纳米生物载体”，可以将BV输送到人体内以对抗癌细胞[48那49］.

结论

生长的菌丝流分布创新性地将其作为FC源，成功地用于NFC的生产和BV加载。BV/NFC纳米偶联物具有良好的结构和生化外观，并增强了其对宫颈癌(HeLa)细胞的抗癌活性。BV/NFC纳米偶联物可诱导HeLa细胞出现严重的凋亡信号，且呈时间和剂量依赖性。强烈推荐BV/NFC纳米偶联物作为有效的天然抗癌剂的应用和额外的评价。

数据可用性

在当前研究期间和/或分析期间生成的数据集可从合理请求的相应作者获得。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

本研究得到了课题组下属的“塔布克大学科学研究系主任”(no。以序列- s - 1440 - 0133)。

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