文摘
事件持续增加的癌症在人类一直强调研究的抗肿瘤物质机制的重要性。从叶中提取的绿原酸(CA),杜仲,已被证实有很多生物活性包括抑制肿瘤。然而,CA的抗癌机制仍不清楚。这里,我们利用一个整体老鼠基因组低聚糖微阵列(4 * 44 k)来分析基因表达水平的雌性BALB / c小鼠(植入EMT-6肉瘤细胞)治疗后较低,中,和高剂量CA(5毫克/公斤,10毫克/公斤,20毫克/公斤),多西他赛,干扰素,生理盐水分别在6个时间点(3日,6日,9日,12日,15日和18天后政府)。差异表达基因筛选的时间序列分析,分析和路径分析,和四个使用RT-qPCR免疫相关基因被选作进一步确认。结果表明,CA是能够改变基因表达,响应基因(可以NFATC2 NFATC2ip和NFATC3)参与免疫途径被CA。表达显著调节免疫因素如IL-2R和干扰素-γ可以改善CA促进T细胞的激活和增殖、巨噬细胞、NK细胞,从而提高他们的监测和杀戮能力,进一步抑制肿瘤细胞的生长速率。
1。介绍
肿瘤休眠细胞学说的观点是:静息细胞的激活是导致癌症转移的关键因素。最近的研究表明,静息细胞可以通过逃避免疫监视,当激活免疫功能减弱,能量用于细胞复兴可以提供的新生血管(1- - - - - -3]。因此,研究提高身体免疫监测和抑制肿瘤生长的能量将是一个紧急的任务,以及临床癌症治疗领域的一个突破。
从叶中提取的绿原酸(CA),杜仲的花蕾金银花confusa,是一种缩酚酸由咖啡酸与奎尼酸形成的。大量研究CA显示CA具有广泛的生物活性,包括抑制肿瘤细胞(4]。根据初步研究,我们认识到CA是能够抑制肿瘤在小鼠除了这些t细胞缺陷,这表明免疫系统可以抑制肿瘤的目标之一。与此同时,在活的有机体内我们小组的研究表明,CA也改变了优势的BALB / c小鼠EMT-6 Th2漂移。它显著增强的活动BALB / c小鼠EMT-6细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞以及增强巨噬细胞吞噬活性和淋巴细胞转录活动,从而提高肿瘤细胞特定的和非特异性细胞免疫功能。最近的研究表明,抗肿瘤性质的CA可能连接的能力提高的活动芳基碳氢化合物羟化酶,抑制8-OH-dG的形成,carcinogen-DNA加合物,和氧自由基5,6]。同时,CA可以防止胃癌和结肠癌,甚至抑制相关的致癌因素(7,8]。在体外研究表明,钙能增强t细胞增殖引起的流感病毒抗原,诱导干扰素的产生γ和干扰素-α由人类淋巴细胞和外周血白细胞(9,10]。此外,我们还发现CA可以激活neurocalcin加强macrophagocyte[的活动11]。虽然证据证明了CA的抗癌特性,在分子水平上对其确切的目标。
基于互补的碱基配对原则,微阵列技术可以区分特定基因与基因的混合利用基因探针。不同于普通PCR, RT-qPCR未知系统的定量分析。与此同时,其灵敏度、准确性和特异性比那些正常的PCR。探索基因的表达水平在肿瘤细胞中,我们利用微阵列技术来检测BALB / c小鼠EMT-6与CA治疗后,多西他赛,干扰素,生理盐水分别和表达水平的差异被RT-qPCR证实。时间序列分析,去分析和路径分析被用来屏蔽常见基因和分析之间的关系假定的基因与抗癌CA的过程。我们的数据表明,CA可以通过调节免疫系统抑制肿瘤的生长。
2。材料和方法
2.1。动物模型建设和CA治疗
女性SPF小鼠(BALB / c)中使用这个实验平均重达17 - 18 g,由四川大学动物中心提供。EMT-6肉瘤细胞由四川大学华西医院提供卫生工程重点实验室的移植和移植免疫。
我们把EMT-6细胞系−152°C的超低温冰箱。解冻后,离心法,主要培养我们用0.25%胰蛋白酶消化然后亚文化所需数量的两倍。所有收集到的细胞与磷酸盐(PBS)稀释。每个BALB / c小鼠注射0.2毫升细胞的解决方案。肿瘤不会转移,直到它增长到一定规模。我们均质肿瘤来自身体的BALB / c小鼠肿瘤细胞悬液,然后将细胞悬液接种到其他BALB / c小鼠。用于微阵列分析小鼠注射大剂量CA(实验组),多西他赛(对照组)和生理盐水对照组(负)。基因表达分析了实验组的六个时间点(3日,6日,9日,12日,15日和18天,分别地。,after administration), while the control group and negative control group were both analyzed at the 12th days after administration. RT-qPCR took mice injected with low, medium, and high-dose CA (5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg) as experimental group, docetaxel and interferon as control group, and normal saline as negative control group. Each of these groups was tested 12 days after administration.
2.2。RNA提取和标签
总RNA提取使用mirVana RNA隔离设备(应用生物系统p / n AM1556)组织收集后15分钟。RNA被分光光度计检查的质量和浓度分析和凝胶电泳。所有提取的样品有一个A260/280比率在2.0和2.1之间,28日18 s / s比2 (12]。安捷伦2100生物分析仪是用于进一步验证和合格的RNA RIN大于7.0。总RNA转录使用RevertAid第一链cDNA合成双链cDNA工具包(Fermentas)和T7启动子引物。aaUTP-labeled的cRNA是互补的在体外转录。cRNA染色Cy3和纯化使用RNeasy迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据协议的RNeasy +迷你工具包。
2.3。杂交和扫描
11 Cy3 cRNA必须分散在一个缓冲区μL 10×阻断剂,2.2μL 25×碎片缓冲和一定量的nuclease-free水60°C杂交之前半个小时。我们添加了55μL 2×GEx杂交缓冲变性和支离破碎的cRNA再转移到微阵列在65°C 17小时不断旋转。杂交后,微阵列与缓冲洗两次1 1分钟后跟缓冲2在37°C 1分钟。最后,微阵列在100%和10% PMT自动扫描两次,分别在5μm分辨率。安捷伦分析的数据特征提取软件和分位数正常化被GeneSpring 10.0完成。
2.4。微阵列数据预处理
原始数据采集后,安捷伦特征提取软件工具被用来消除背景信号通过自动网格的影响。我们采取规范化的日志2背景调整值缩小荧光信号强度的阈值之前分位数正常化GeneSpring 10.0,然后用线性模型来估算表达式值对数尺度。两个项目在limma包可用。我们选择一个标准的芯片样品因此整个微阵列数据变化来获取相同的平均密度的基线。不合格的探测器应该过滤掉。差异表达基因是提交给学生的以及和。
2.5。相互作用网络分析
我们输入数据探针用于基因表达分析的南方浸信会分析系统(V2010.05)。
2.6。RT-qPCR
RNA提取实验群CA,阳性对照组多烯紫杉醇,干扰素,阴性对照组用来测量RT-qPCR选择感兴趣的基因的表达。基因可以,Nfatc2 Nfatc3, Nfatc2ip显示不同的表达水平较低的治疗后,中、高剂量CA,分别。引物用于RT-qPCR验证设计根据南方浸信会的每个基因序列和完成。加入引物名称、数量和序列表中列出1。
使用试剂盒试剂总RNA是孤立的。RNA的RNA完整性验证了甲醛电泳,用分光光度计检测质量。的RNA样品有A260/280比率大于2和20 srna / 18 srna比率大于1.1。单一使用RevertAid链cDNA合成第一链cDNA合成装备。在42°C逆转录反应进行了30分钟和5分钟的85°C 20μL反应总额包含以下试剂:2μL RNA, 1μL益生元,2μL(10毫米)核苷酸混合物,1μL RiboLock核糖核酸酶抑制剂,4μL 5×反应缓冲区,9μL水,1μL RevertAid M-MuLV。PCR进行使用嘉汉生物Taq 2×掌握混合。RT-qPCR产品1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
在温度梯度PCR反应应采取的退火温度范围,Nfatc2 Nfatc3, Nfatc2ip。RT-qPCR进行分析获得交叉点(Ct)的每个基因值和标准曲线建立了通过Ct值之间的线性和对数表达式值的2。之前执行RT-qPCR分析、互补和引物应稀释20μL试剂包含以下几点:9μL混合,8μL H2啊,1μL底漆(F), 1μL反义底漆(R)和1μL的互补。相同的循环参数重复了40倍。相对含量实验组的信使rna提取,多西他赛的阳性对照组,干扰素负对照组被RT-qPCR检测系统计算BIORAD IQ5。
3所示。结果与讨论
3.1。接受治疗后肿瘤细胞的基因表达谱
34275调查没有重复组合和过滤后被保留。我们进行了一个学生的以及这些探测器的选择差异表达基因(),然后画曲线反映出不同的表达趋势的6个时间点。八十个不同的曲线拟合后曲线得到。越小每个基因值是,类似的趋势与曲线的吻合程度。NO.21拟合曲线了值接近于0和覆盖的基因表达谱拟合曲线进行了分析系统。如图1,每个拐点对应的基因表达在不同的时间点后管理。基因覆盖在这条曲线调节从整个时间周期;换句话说,CA可以上调某些基因的肿瘤的老鼠。
基因数据覆盖NO.21被SBC分析系统(V2010.05)并与KEGG数据库(京都基因和基因组的百科全书)。如表所示296路径发现与调节基因,其中29发现统计学意义包括t细胞受体信号通路,b细胞受体信号通路,自然杀伤细胞介导的细胞毒性。治疗后免疫相关基因表达speculated-changed CA和可能upregulation的趋势。先前的研究在CA免疫功能验证,CA可能增加碳间隙指数和血清溶血素的含量,提高吞噬功能。干扰素的表达水平γ而增加il - 4 - 2, il - 10减少。肿瘤坏死因子的释放(TFN的)被发现减少而激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL),旨在路易斯肺癌了。NK细胞活化的淋巴细胞转化率Lewis肺癌轴承老鼠都显著提高免疫功能指标的测定。总之,CA已经证明能够加强肿瘤细胞免疫功能。当3免疫相关的通路被发现包括调节基因,我们推断,治疗后小鼠的免疫力已经改善CA, GSK3B NFATC2, NFATC3,可以发现VAV2, NCK1调节免疫相关通路在3中列出的表3。根据功能,基因覆盖在NO.21可以分为312种不同的基因(本体)和6有一个值小于0.05中列出的表4。统计学意义包括以下基因:Cyp2a4, Cyp2c37, Cyp2c38, Cyp27b1, Cyp51, E4f1, Fdps, Gata4, Eif2ak1, Myt1l, Rarg, Sod1, Sp1, Taf3, Nr2c2, Hnf4g, Zdhhc3, Phf6, Mynn, Zfp386, Zfp617, Zfp114, Zfp238, Zfp174, Zfp113, Zfp109, Zfp263, Pcdhb6, Pcdhb15, Pcdhb20, Pcdhb21, Cdyl, Nfatc3, Pbx2,休息,Smarca5, Nfatc2。后做一些查询的功能基因在统计上显著的路径,我们发现免疫相关基因和通路的共同基因。Nfatc2、Nfatc3 Nfatc2ip,可以发现通过梳理原始分析数据的基因表达谱,如表所示5。
3.2。通过荧光定量PCR验证差异表达基因
目标基因的相对表达水平Nfatc2, Nfatc3,平均Nfatc2ip,如表所示6。Nfatc2的相对表达水平,Nfatc3 Nfatc2ip,可以在高剂量组,Nfatc2ip在中等剂量CA集团,可以在低剂量组与阴性对照组相比显著提升。确切的表达量如图2。
(一)
(b)
(c)
(d)
如图2Nfatc2ip的相对表达水平,Nfatc3 Nfatc2,并能在高剂量组与阴性对照组相比,进步,对应于微阵列分析的结果。
3.3。讨论基因Nfatc2ip Nfatc3 Nfatc2,可以
在这里,一个老鼠基因组低聚糖微阵列(444 k)是用于分析基因表达水平的雌性BALB / c小鼠和比较每组的相应的目标基因的表达时间序列。系统误差和偶然误差会影响微阵列分析的准确性在一定程度上和错误可能来自RNA提取的过程,RNA逆转录,杂交和基因芯片和RNA的质量。虽然微阵列分析的结果可以反映出身体内部的基因表达模式快速水平,假阳性结果可能引起系统误差和偶然误差必须考虑。验证试验和ELISA试验、免疫印迹试验和PCR测试应采取进一步确认。这里,PCR测试的结果帮助完成这项研究以及使其更有说服力。通过分析基因包含在NO.21, t细胞受体信号通路中关键基因的表达,b细胞受体信号通路,和自然杀伤细胞介导细胞毒性已经改变和免疫相关基因Nfatc2ip, Nfatc3 Nfatc2,可以被发现。
NFAT(核转录因子激活T细胞)由4组件NFATc1 NFATc2, NFATc3, NFATc4证明重要的淋巴细胞活化和发展。Nfatc2存在于细胞质把原子核在t细胞受体刺激,然后成为一个成员的核转录因子的激活t细胞(13]。当身体缺乏NFATc2,淋巴细胞凋亡会显著降低,表明淋巴管扩张和th2型反应。与此同时,Th1 / Th2平衡将被破坏,这表明Th2极化。免疫调节功能障碍当Th1 / Th2平衡遭到破坏和肿瘤发生显示的优势状态趋势Th2。这个状态将削弱抗肿瘤免疫功能,诱导肿瘤细胞免疫监视和免疫攻击。这可能是一个肿瘤免疫机制的发展和提供了一种新的肿瘤治疗的想法。相反的Th1 / Th2异常漂移有利于恢复抗肿瘤免疫能力,减少肿瘤复发和转移,提高长期生存率。
NFATc2和NFATc3证明协同调节T细胞受体的反应,细胞分裂和Th2细胞分化。th2型反应表明分泌il - 4, IL-5,以及il - 6的分泌增加而减少2,IFN -γ肿瘤坏死因子-α和il - 10当身体缺少NFATc2 NFATc3 [14- - - - - -16]。当B细胞和T细胞缺乏NFATc2和NFATc3同时,T细胞的功能将减弱,但T细胞受体介导细胞增殖的能力仍然存在,而B细胞over-activate和显示过度分化17]。表达NFATc2和NFATc3改善治疗后的CA间接表明,CA可以反向Th1 / Th2漂移。与此同时,- 2分泌干扰素-γ肿瘤坏死因子-α,il - 10与CA。高表达的NFATc2和NFATc3赞成这些细胞因子的分泌已经作为非特异性免疫治疗癌症。NFATc2ip可以诱导t细胞细胞因子的表达,尤其是增强IL生产。三个接头存在的变异NFATc2ip甲醇能够NFATc2ip翻译后产生NFATc2ip监管因素。Th1-type和th2型细胞因子的表达时将抑制抑制甲基化过程。因此,NFATc2ip的甲基化过程是一个重要的控制的操纵NFAT-dependent细胞因子的表达,但它不会有任何影响一般Th1、Th2和NFAT激活的转录因子。
可以(钙调磷酸酶)被认为是唯一的丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸酶由Ca (2 +)钙调蛋白到目前为止,主要针对催化脱磷酸磷脂酰丝氨酸和磷脂酰苏氨酸。它是一个多功能信号酶参与许多细胞功能调节和分配在一个广泛的组织特别是神经组织,T淋巴细胞,心脏和骨骼肌18,19]。NFAT家庭的主要底物。NFAT调节许多基因表达以及影响细胞分化通过可以/ NFAT信号通路。能够能NFAT细胞质中存在脱磷酸作用完成后进入细胞核转录和翻译,然后Nfatc可以结合AP-1家庭成员单独或一组刺激分泌的细胞因子在某些领域如- 2。转录诱导- 2是t细胞活化的标志。如前所述,NFAT在调节免疫反应是非常重要的;与此同时,NFATc3和NFATc2扮演一个特别关键的角色在纠正身体的免疫功能。因此,高表达的可以是NFAT的好处去磷酸化,间接影响免疫系统。
4所示。结论
微阵列分析的结果的差异表达基因的雌性BALB / c小鼠EMT-6表明,CA的抗肿瘤机制是与人体的免疫系统密切相关。NFATC2,通过移植的表达可以NFATC2ip, NFATC3, CA是能够提高免疫因子的转录IL-2R和干扰素-γ,刺激增殖和活化的T细胞,NK细胞和巨噬细胞,加强监测和杀死癌细胞的能力,最后,抑制肿瘤的发展。CA的抗癌机理的理解提供了一个可靠的证据利用CA对抗癌症。
信息披露
花荣杨和杰,受雇于Jiuzhang生化工程科技发展有限公司有限公司是这个项目的合作伙伴。所有其他的作者是华西药学院的研究者,四川大学,没有利益冲突。试剂支持的基金(四川省科学技术支持项目资金2011 sz0131)的这个项目。试验的某些部分委托给第三方而不是由它。这句话是充分披露的利益,而不是因为作者认为这是一个利益冲突。
确认
四川省科技支撑项目资金2011 sz0131支持这项工作。作者要感谢刘宏伟(上海生物芯片有限公司)在微阵列分析对他极大的帮助。