SERPINA1mRNA处理 Alpha-1抗药性缺陷

抽象性

ALPINA1基因编码AAT突变生成非活动/失效AAT与该疾病相关联的是AAT肺活度下降和肝脏多缺陷AAT蛋白沉降目前没有肝病专用处理方法与AAT缺陷相关AAT肺病常使用数种血清蛋白替换产品但没有长期研究SerpinA1替换法,无法减少AAT缺陷中的肝损伤mRNA治疗可能同时针对AAT缺陷病人的肝肺AAT病人纤维化和AAT病人纤维化衍生肝细胞用SERPINA1编码mRNA转导,细胞培养媒体测试SerpinA1表达式serpinA1培养介质从处理AAT病人纤维化和AAT病人Fiblast衍生肝细胞增加野性小鼠Vivo研究显示SERPINA1 mRNA肝肺生物分布以及SerpinA1蛋白表达综合数据显示SerpinA1mRNA治疗有可能使AAT缺陷患者受益

开工导 言

Alpha-I-antripsin缺陷(AATD)是一种毁灭性疾病,缺乏适当的治疗方法当前治疗方法只保护肺部,高级案例需要频繁静脉注入血浆衍生AAT蛋白AATD患者易患阻塞性肺病和肝病(例如儿童与成人肝硬化和肝细胞癌)[一号-3..约1-5%诊断慢性阻塞性疾病(COPD)患者估计有alpha-1抗原素缺陷4..极稀有,但报告AATD儿童肺气肿3肝病发病率随年龄增高3..严重症状晚生出现,特别是在冒烟者中AATD肝征兆晚期可见并经常需要肝移植AATD遗传疾病SERPINA1基因组5..SERPINA1基因有二异名meles产生严重AAT缺陷的最常用词代法称Z(E342K)〔E342K++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++6,7..据报95%重AATD病人有ZZ基因型,只有10-20%SerpinA1血清水平6..遇有ZZ变异 SerpinA1蛋白无法正确折叠,因此AATD不是因无法制作蛋白质引起的,而是因为无法分解功能性蛋白SerpinA1累积 hepatocites导致严重的肝损伤6..同声PIZZ相当常见 并发生于北美和欧洲1:2500-300

Alpha-1-antripsin(AAT),又名SERPINA1(serineprete5,8..serpinA1循环glycoprotein 水溶性组织易辨性5..SerpinA1的首要作用是 srine蛋白调控,SerpinA1绑定和停动中微粒弹性体,从而保护向量组织不受发炎反应期间原教分解退化九九..SerpinA1最丰富的循环反耗和正常等离子聚常达1-2g/L5..

AATD特征表现为误叠SerpinA1蛋白质聚合化6..serpinA1血清水平低于50 mg/dl,正常水平为200mg/dlSerpinA1低循环量,肺部不受中子弹性体保护,该酶摧毁alveli并引起肺病因此,AATD最常见的临床并发症是肺气肿和肝病[10..

迄今只有AAT增强治疗AAT增强疗程开发于1987年,目前仅获准用于选择重AATD相关肺气管6,11..AAT扩增只帮助向肺提供SerpinA1,帮助预防中子弹性体损坏血清缺缺并非肝损伤原因,因此没有为与AATD相关肝病患者提供特殊治疗唯一治疗方式是支持性护理典型肝衰竭和肝移植12..

AATD是一种单源失序症,它成为MRNA理疗的理想目标mRNA是一种新颖模式,可能适用于各种疾病,因为它比传统生物和酶替代治疗法具有巨大的弹性。mRNA治疗使用宿主细胞内生机制生产和翻译后修改目标蛋白质,从而开发以前非目标性疾病的治疗方法体外编码SerpinA1定位MRNA/portein

mRNA疗法可能同时针对AAT缺陷病人的肝肺(等待当前实验)。显示SerpinA1蛋白质增加 细胞培养介质处理AAT病人纤维化, 细胞培养介质处理AAT病人纤维化此外,WT动物通过静脉注射接收SERPINA1mRNA时,SERPINA1mRNA和SerpinA1蛋白都观察到肝肺局部化mRNA介面表示肺部SerpinA1蛋白可抑制中子弹性体,同时可促进肝脏MM异形表达法并为AAT病人提供多线益

二叉材料方法

2.1.AATD病人分片

细胞文化条件.从Coriell医学研究院手机存储器(Camden,NJ):GM11423和GM12445从AATD病人肝脏和GM02522从AATD病人皮肤和正常控制Fiblast线ND34769从皮肤获取GM11423和GM12426Eagle最小基本介质生长细胞,厄尔盐和非必备氨酸(热渔科学公司、华特汉马)补充15%子黄素血清,并在37°C注入5%CO₂.

移植条件.病人纤维卷转2.5ug/mRNA和4华府mRNA-In脂移植试剂3项独立实验中每次复制3项生物mRNA稀释为2.5华府g/OptiMEM(TermoFish科学公司、Waltham和Ma)和类似适当卷mRNA-In在OptiMEM每井稀释,并按制造商推荐执行协议稀释式mRNA混合稀释式脂质并允许在室温浸泡15分钟后加入细胞添加 mRNA-lipd混合到病人纤维裂变后,细胞用5%CO返回37摄氏度时孵化器₂.24小时后细胞温柔洗两次PBS并浸入RIPA新缓冲Louis,MO)带1x预感抑制器Louis,MO)

细胞解析和总蛋白量化:用0.5mL管收集病人纤维状细胞液化物(Eppendorf,Haburgdorf,Durgede)和离心机在4°C时18000xg清除细胞碎片离心分离后,清晰超生谨慎转置到单条贴标签管并贴上冰块完全蛋白浓度由BCA测试包(Excess科学公司、Waltham和MA)按制造商协议以96well格式重复确定

Wes自动化毛虫电阻SERPINA1表达式.最终样本5华府单以0.4 mg/ml蛋白浓度编译液晶系统使用蛋白简单Wes大小滑动电阻系统分析ProteinSemple, San Jose,CA)大小分解蛋白于1:125稀释式检测SERPINA1型抗体NVUSNBP1-90309,Novus生物学士Littledoxin和管家Thiordoxin单行道下区域SERPINA1归并Thiordoxin控件AUC

2.2.Alpha-1抗药性低位遗传细胞

细胞文化条件.AATD由病人生成的肝细胞由EfiniGen使用专有差别协议生成DTM媒体和DRM媒体(DefiniGen,剑桥UKK)生长细胞,每井50万个细胞贴上24小时板块细胞缺氧条件在37摄氏5%₂和5%O₂媒体根据专有制造商协议转包前每隔2天换10天(DefiniGen英国剑桥市)。细胞生长缺氧按厂指令计算,允许细胞生长,非天花条件降低细胞生长

转基因条件和蛋白表达式ELISA.aTD Hepatocytes通过三次独立实验并每次三次生物复制细胞孵化24、48和72小时后细胞培养介质消除并补齐SerpinA1蛋白浓度使用Abcam(Cambridge,MA)ELISA并遵循制造商协议

2.3维沃市学习

所有实验、动物宿主、处理和实验程序/协议均获批准并按亚历克西安药厂IACUC指南和规则C57BL/6雄鼠(6周大)用于本研究鼠标存放温度控制环境12h/12h光达循环,标准饮食和水自来水

mRNA编译成LipidNanop粒子和VivoDosing.mRNA构造使用自组装内含SERPINA1 mRNA的可变油纳米粒子GFP编码mRNA作mRNA载运车辆控制使用,PBS作负控试mRNA快速混合编译pH4.0与脂质混合-Hepatopo9mRNA包-Pricision NanoSystems单静脉注射1.5 mg/kg配方mRNA穿插尾静脉动物在注入24小时后牺牲,组织固定处理现场混合化和免疫史化学

样本采集和FFPE样本准备.动物腐烂,左侧叶封装组织盒(Fisher科学)盒装箱装满10%中性缓冲正式NBF定型解法,最小为组织体积比1:20比定式解法样本允许修补最少24小时,但在室温下不超过48小时组织修复后,磁带放入装满PBS容器不超过3天PBS清洗后处理肝组织并嵌入石蜡块

2.4.Imnothisto化学和Situ混合程序

SERPINA1名名名词化学师华府m组织段使用抗体SERPINA1LeicaBONDRX平台(Leica生物系统公司、Leica微系统公司、Buffa抗原检索标准leicaBONDRX平台使用leicaER1EDTA-Trisp8.0幻灯片分级脱水乙醇序列,清二元并用Cytseal安装幻灯片用VS120系统放大

mRNA可视化现场混合完成自定义RNA现场混合探针设计SERPINA1 mRNARNASH自动解析使用ViewRNAeZ-L检测包(Affemitrix,Santa Clara,CA)和LeicaBONDRX平台(Leica生物系统,Leica微系统公司,Buffalo GroveIL)形式化嵌入式组织以5微米厚玻璃滑板编译并装上LeicaBONDRXViewRNAeZ-L检测程序按制造协议运行,但简略地说,RNA在95摄氏度时用10分孵化SERPINA1:40检测稀释为确保RNA完整性和检测程序,补充段还混合成peptidyl异构体B检测器(PPIB),内生内管蛋白用于对ISH阳性控制.控制非专用染色物时使用细菌蛋白二二叉酸后处理器负控所有探针分解1:40滑动片为空气干燥,清新二元并用Cytseal安装幻灯片用VS120系统放大

3级结果

3.1.mRNA-Derived人类SerpinA1细胞轮廓和细胞介质表达式

人类SERPINA1mRNA从TriLink转入AATD病人纤维片,取自Coriell学院人体SerpinA1蛋白表达式大增1(a)和细胞文化媒体1(b))或野型或FLAG标签式SerpinA1转接

SERPINA1 mRNA转包使用从DefiniGen获取的主肝细胞WT SerpinA1蛋白注入培养介质的保密度在24小时提高,而车辆控制量仅为GFPmRNA我们看到SerpinA1蛋白表达式随时间持续增加,转口后48h和72h见此2)

3.2Vivo人类SerpinA1表达式WTMice

人类SerpinA1蛋白表达式后在WTC57bl/6鼠标中评价SERPINA1 mRNA肝脏检测3(a)mRNA封装成一脂纳米粒子,通常将大量货物交付肝脏有趣的发现是SERPINA1mRNA也在小鼠肺部检测到3(b))SerpinA1蛋白表达式使用人专用SerpinA1抗体检测SerpinA1两种肝脏都见蛋白质3(c))和肺部3(d))SerpinA1蛋白表达式的直销分布模式显示SerpinA1蛋白可能被肝细胞隐藏进血液中

4级讨论

AATD是一种毁灭性疾病,需要高效治疗以惠及病人当前增强治疗不足以避免对AATD病人肝脏的长期损害目前多组使用新模式提供急需的治疗方法,如基因理疗举例说,骨髓干细胞移植已在AATD小鼠测试并展示出某种拯救肝细胞退化13..Gene替换策略也在诊所测试14,15WTSERPINA1基因插入肝脏并表达适当的SerpinA1蛋白当前方法仍需要优化,AAV介导基因传递可导致抗体分解下降或病毒封装免疫反应

sERPINA1 mRNA瞬时表达作用评估鼠肝脏,因为mRNA交付肝脏相对直截了当并通过脂纳米粒子建立,我们可以管理LNP封装mRNA而不产生重大免疫反应初始时,我们在AATD病人纤维化和从病人FIBLAST基础肝细胞测试我们的假设数据清晰显示,我们可以用mRNA编码SERPINA1并随后从两种细胞中表达SerpinA1蛋白serpinA1蛋白素隐蔽于这些细胞中,蛋白素水平可用超纳特/细胞培养介质测量这就意味着MRNA编码SerpinA1蛋白在细胞内折叠并适当修改,以便分解出ER并插入细胞培养介质,而细胞培养介质是MRNA理疗的关键特征使用mRNA理疗,我们可以使用人体自己的细胞做工厂合成蛋白质,后译修改它,并最后将其分解入流细胞培养介质初步分析显示,隐式SerpinA1在中子弹性抑制检测中具有酶活性(数据未显示)。数据数字一号,2并3SerpinA1蛋白质水平比基线或负控制水平高得多水平应足以减少等离子体和肺中的神经元弹性活动,从而防止逆向退化和肺气肿,这是AATD特征

扩展研究以确定mRNA编码SERPINA1实验显示静脉注射人体SERPINA1mRNA3(a)并3(b))并封装 mRNA理疗可能以AATD网站(前置和肺部)为对象更重要的是,人类SerpinA1蛋白同时生成WT鼠肝肺3(c)并3(d))SerpinA1蛋白表达模式显示,蛋白质由肝细胞或像星格等其它肝细胞类隐藏,这些细胞通常表示SERPINA1数据无法排除 mRNA除肝细胞外进化或表达的可能性,人体SerpinA1蛋白有可能来自两个源码:SERPINA1 mRNA通过i.v深入肺部并隐蔽人类SerpinA1 由人类SERPINA1MRNA生成肝脏serpinA1蛋白表达法和肺肝定位潜力大有希望,因为它可阻塞肺部中值弹性损伤,同时可能减少肝部PIZ后一种假设基于Karadagi等人的研究[九九SerpinA1蛋白因增强法显示PIZZ格式下降mRNA编码SerpinA1蛋白表示肝脏时有可能减少PIZ表格肝生成并随后抑制肝纤维化阻塞肝纤维化ER压力最终可减少/消除AATD病人肝移植需求需要用AATD模型测试我们的假设,该模型显示肝纤维化并转入肝细胞癌

这些数据令人振奋,但我们要指出MRNA疗法需要改进,以便有可能为AATD病人提供慢性福利外送 mRNA当前半衰期通常24-48h组织,而蛋白半衰期视蛋白质及其分解机制而异增加MRNA半衰期的战略目前正在调查中,早期数据显示,通过调和UTRs侧翼codon优化mRNA[16..推理蛋白工程策略还面向促进蛋白半衰期增加,结果增加酶活动并最终减少对mRNA疗程的服药需求17..新改进可产生mRNA理疗法,该理疗法不常下药并保持足够的酶活动,例如SerpinA1蛋白质,以提供临床改善提高 mRNA疗程的另一个方面是LNP安全交付,据此我们可以每隔几周用LNP剂量一次当前的LNP技术促进月复一例使用机制,但如果配对有效则不支持更频繁使用如前所述,LNP封装mRNA疗法可重用,不同于AAV原型疗法,剂量可编译以提供最大病人福利

5级结论

研究显示新治疗模式MRNA法的潜力,即缺失或非功能性蛋白可以替换实现正常功能实验结果显示,脂封型mRNA可瞄准肺和肝脏,而肺和肝脏是AATD的两个主要病源前研究探索mRNAAATD显示24hA549和HEK293细胞蛋白表达法18号serpinA1蛋白表达方式并生成SerpinA1蛋白对病人实用性相关需对AATD疾病模型作进一步研究,并确保鼠类和上层动物多服MRNA安全后再考虑人类使用该模式mRNA使用SERPINA1mRNA

数据可用性

文章中提供所有数据支持结果没有其他数据可用

利益冲突

所有作者都是亚历克西翁药厂公司员工和股东,公司开发稀有和超然疾病的治疗方法

作者贡献

布伦登康诺利设计并展开细胞培养、转口和活体样本处理CleoIacas设计并实现IHC黎成设计并展开ISH实验、手稿写作和体文研究基尔提卡asrani执行西方染色体、免疫标定和活体采样处理RomeshRSubramanian设计实验、审查数据并写手稿

感知感知

阿历克西翁制药公司接受资助

引用

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