DNA连接酶IV防止复制叉停滞和促进细胞增殖在三阴性乳腺癌

抽象的

DNA损伤是癌症的标志，并且维持基因组保真度的蛋白质的突变和误解与多种癌症的发育有关。DNA双层断裂可称谓是最有害的DNA损伤类型。非同源终加工（NHEJ）途径是修复DNA双链断裂的一种机制，并且参与NHEJ的蛋白质也可以调节DNA复制。我们以前建立了DNA-PKCS，NHEJ蛋白，促进细胞暴露于复制应力后的基因组稳定性和细胞活力;我们想辨别是否另一种NHEJ蛋白，DNA连接酶IV（Lig4），分享这种表型。我们的调查专注于三重阴性乳腺癌细胞，与非群母乳腺癌相比，Lig4.，并且增加的基因剂量与较高的Lig4表达有关。我们使用siRNA去除了Lig4，并通过qPCR和western blotting证实了该基因的下调。仅在Lig4耗尽时，细胞存活率降低，这与复制叉停止增加有关。在lig4缺失的细胞中，检查点蛋白Chk1的激活和去磷酸化没有变化。在羟基脲暴露后，Lig4缺失导致DNA-PKcs持续磷酸化。了解Lig4对基因组复制和复制胁迫反应的影响将阐明抑制Lig4活性的生物学后果。此外，Lig4是一个有吸引力的临床靶点，可以引导CRISPR/ cas9介导的修复朝着同源性方向修复，并远离NHEJ，因此理解Lig4减弱如何影响细胞生物学至关重要。

1.介绍

完整的DNA损伤是癌症的标志，DNA损伤反应蛋白的异常功能已知与许多癌症亚型相关[1］.许多化学治疗药物诱导复制应力和结果DNA损伤;因此，DNA修复途径调节对化学治疗介入的细胞反应，可以影响耐药性的发展。可以可以说是最有害的病变，DNA双链断裂（DSB）可以出现由内源性和外源源引起的损伤，包括但不限于电离辐射，遗传毒性化学品，复制误差和反应性氧和氮气的产生。在哺乳动物中，DSB主要由两个主要途径修复：同源重组（HR）和非博学终端连接（NHEJ，审查，请参阅[2那3.])。NHEJ是哺乳动物细胞中DSB修复的主要途径[4.而与HR不同的是，修复不依赖于同源DNA模板的可用性。与NHEJ相比，HR被认为是“无错误”的，这是由于模板的使用，是细胞分裂过程中负责DNA复制叉重启的主要修复途径。

在NHEJ介导的修复中，DSB被Ku70 / Ku80二聚体识别，所述Ku70 / Ku80二聚体招募DNA-PKCs，Astemis和DNA连接酶IV（Lig4），XRCC4 [2］.Lig4在NHEJ的最后步骤中催化磷酸二酯键形成[2］.Lig4的C末端结构域包含侧翼XRCC4相互作用域的两个串联阵列的BRCT结构域，其促进其与其结合伴侣XRCC4的相互作用[5.那6.］.结束处理可导致断裂部位的小插入或缺失，因此与人力资源相比，NHEJ被认为是更“易于忽略”的修复途径，但它修理了大多数蜂窝DSB [4.］.虽然DNA连接酶I和III参与其他形式的DNA代谢，但Lig4的活性与NHEJ相比[2］.虽然“古典”NHEJ，细胞中的主要DSB修复途径与Lig4相关，但是通过替代端连接途径的修复可以由DNA连接酶I或III介导[7.-9.]但是这些不是经常使用的。

除了DSB修复之外，HR在减轻DNA复制应力中的作用是众所周知的[11.];然而，NHEJ蛋白还可以调节细胞恢复尚不清楚。由于无法完全激活/磷酸化细胞蛋白，包括RPA32，CHK1，包括RPA32，CHK1，包括RPA32，CHK1，以及磷酸化细胞蛋白，包括RPA32，CHK1和磷酸化细胞蛋白，缺乏早期作用的NHEJ蛋白，DNA-PKC，重新启动DNA复制的细胞，所述DNA-PKC比野生型更快地重新启动DNA复制。γh2ax [10.那12.那13.］.为了辨别出异常复制重启是由于NHEJ的功能障碍，我们击倒了Lig4，以确定它是否在调节无重点和/或受损的DNA复制方面具有类似的作用。我们研究了Lig4是否可能是一种疾病的推定治疗靶标，其中HR经常受到损害，即三重阴性乳腺癌（TNBC）。

TNBC是缺乏核雌激素受体和孕酮受体的乳腺癌的临床亚型，并不过表达生长因子受体HER2。虽然并非所有基础癌症都是TNBC，反之亦然，基础样TNBC与较低的存活相关[14.]是TNBC最常见的分类，占患者的约70-80％[15.］.TNBC患者患有差的预测差[16.]、较短的无复发生存期、较高的复发风险[17.]与其他乳腺癌类型相比，由于肿瘤复发而导致染色的风险增加[18.］.虽然TNBC患者总体预后较差，但5年后复发和肿瘤相关死亡的风险降低到与非TNBC患者大致相同的水平[19.］.这表明TNBC患者的生存高度依赖于防止复发和化疗耐药性。大约80%的HR蛋白BRCA1遗传突变患者存在TNBC，另外61-69%的患者具有以下特征:BRCA与39%的其他乳腺癌亚型相比[20.］.因此，TNBC患者经常受到影响，这可能导致TNBC患者特别依赖于NHEJ介导的DNA修复。因此，我们试图了解TNBC靶向Lig4的潜在治疗值和降低Lig4的细胞分枝。增加的NHEJ有助于在TNBC中产生对化疗的抗性[21.]，因此通过干扰Lig4靶向该通路可能为TNBC提供一种新的治疗方案。

2.材料和方法

2.1。TCGA分析

使用cbioportal询问TCGA数据库[22.那23.］.在元数据集中分布的所有乳腺癌中评估Lig4，基础仅子集和除了基础亚型中的所有乳腺癌类型[24.］.表明观察到的基因组改变的野外申请。cbioportal用于获得Lig4.使用Illumina人V3微阵列产生的mRNA表达Z分数，允许比较具有mRNA表达水平的基因组改变（深缺失，浅缺失，二倍体，增益或扩增或扩增）。CBIoportal网站上提供了这些术语的定义：http://www.cbioportal.org/faq。持续到2018年8月的本项目中使用的数据访问数据库。

2.2。细胞培养

除非另有说明，所有实验室化学品均购自Sigma Aldrich (St. Louis, MO)。人乳腺细胞系BT549或MDA-MB231从ATCC (Manassas, VA)获得，并在5% CO下生长₂在37°C以100％湿度。基础介质（Life Technologies; Carlsbad，CA）如下：BT549：DMEM / F12，MDA-MB231：DMEM，各自辅以10％FBS和100个单位/ mL青霉素/链霉素（Life Technologies）。用siRNA靶向Lig4（Qiagen; Hilden，德国，猫#si00036022）转染细胞或在10nm下使用Rnaimax（Life Technologies）以表示指示的时间。使用蛋白质印迹和/或QPCR来确认Lig4的敲低。

２.３.qPCR

根据制造商的说明，使用RNEasy Mini Kit（QIAGEN）与细胞中柱基因组DNA消化分离出RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计（Fisher Scientific，Hampton，NH）量化RNA。将RNA样品在-80℃下储存直至进一步分析。cDNA用1合成μG RNA根据制造商的指示使用IScript cDNA合成试剂盒（Biorad，Hercules，CA），然后用核酸酶免费水稀释至最终浓度为10 ng /μL.使用ITAQ通用SYBR Green Supermix（Biorad）使用CFX连接实时PCR检测系统（BiORAD）进行QPCR。使用的底漆序列如下：Lig4：5'TGC TGC TGA GTT GCA TAA TGT 3'，5'AGC AGC标签CAT TGG TTT TGA 3'（针对X83441.1设计）;GAPDH：5'ACA GTC AGC CGC ATC TTC TT 3'，5'ACG ACC AAA TCC GTT GAC TC 3'（针对NM_002046.7设计）。在QPCR中使用之前，我们向我们保证了我们的引物组未产生引物二聚体，并评估引物效率，以确保不同起始程度的模板的平等扩增。将前向和反向引物以0.5的最终浓度使用  μm具有50 ng cDNA。QPCR条件为95°Cmin, 40个循环，95°C (30s)， 60°C (30s）和72°C（15s）随后是熔体曲线。目标的CQ值被标准化为GAPDH的CQ值通过方法 [25.］.对扩增子进行测序以确认特异性（数据未显示）。

２.４.DNA纤维测定

如上所述，用SiRNA靶向Lig4或NT转染BT549细胞。用胸苷类似物5-Iodo-2'-脱氧尿苷（IDU; 20μm）在完全生长培养基中，在37℃下孵育15分钟。除去培养基，用PBS洗涤细胞三次，然后用胸苷进行短暂洗涤（100μm）。然后将细胞暴露于含有第二胸苷类似物5-氯-2'-脱氧尿苷（CLDU; 20的新培养基μm）在37℃下20分钟。或者，在原始IDU脉冲之后，然后在37℃下用羟基脲（Hu，10mM）或载体（PBS）用羟基脲（Hu，10mM）或载体（PBS）处理细胞。除去培养基，用PBS洗涤细胞，然后用CLDU脉冲（20μM)在37°C下放置30分钟。在暴露于两种胸苷激酶类似物后，对细胞进行DNA纤维分析[10.］.用PBS洗涤细胞，用胰蛋白酶收获细胞，然后在PBS中重悬。二千个细胞被转移到一个带正电的显微镜幻灯片(Superfrost +国家,弗农山,IL),细胞溶解与裂解缓冲(0.5% SDS, 200毫米三pH值7.4,50 mM EDTA),在室温下和孵化3分钟。幻灯片在一个角被取消允许DNA纤维分布在幻灯片的长度,再次风干8分钟，在4℃70%乙醇中保存过夜。第二天，玻片在100%甲醇中孵育5分钟，用PBS冲洗。除蛋白是由孵化在2.5 N HCl 37°C 1小时后通过阻断5%牛血清白蛋白在37°C,持续15分钟。IdU和CldU检测顺序使用荧光标记的第二抗体,抗体孵化项目都进行45分钟在37°C。简单地用小鼠抗brdu抗体(Fisher Scientific)检测IdU，然后用山羊抗小鼠Alexa 568 (Life Technologies)检测IdU。使用大鼠抗CldU (Accurate Chemicals, Tempe, AZ)和次级驴抗大鼠Alexa 488 (Life Technologies)检测CldU。所有抗体在0.5%牛血清白蛋白中稀释，用PBS冲洗。使用延长™Gold Antifade Mountant (Fisher Scientific)安装载玻片。 DNA fibers were visualized and captured using a Zeiss Axioimager Z1 motorized microscope equipped with a XCite LED epifluorescence light source, Apotome 2 structured illumination module and Axiocam 506 CCD camera. Replication forks labelled only red (IdU positive only) were defined as stalled forks, those labelled only green (CldU positive only) were defined as new forks and those labelled both red and green (IdU+CldU) were defined as restarted forks. Images were scored by the person who was blinded to the sample identity. Data was analyzed as stalled or restarted or new forks and determined as a percent of the total number of forks scored per image. Mean, standard deviation was calculated for each treatment condition from all the scored images per condition.

2.5。Western Blotting.

BT549细胞以每盘500,000个细胞的浓度在60mM培养板中生长。转染后24小时，用四种机械手法不同的复制毒素（Doxorubicin，Dox，1μM;埃托普西德，etop，10μM;胡，2毫米;Camptothecin，CPT，0.2μM）或载体（DMSO）和蛋白质在24小时后萃取。对于PCHK1和PCHK2实验，BT549将细胞用10mMU或载体（PBS）处理1小时，或在处理后立即收获24小时。对于CHK1和CHK2去磷酸化实验，将BT549细胞用10mm HU或PBS处理1小时，并释放出指示的时间，然后释放出蛋白质收获。对于PDNA-PKCS S2056实验，将BT549细胞用10mm HU或PBS处理1小时或24小时，并在完全细胞生长培养基中释放2小时，然后进行蛋白质收获。使用ripa缓冲液获得全细胞裂解物[50(pH值7.4)，2mM EDTA, 150mM NaCl, 0.1% SDS, 1.0% Triton X-100)补充Halt磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物(Fisher Scientific)]。按照制造商的说明，使用Pierce BCA蛋白测定法(Fisher Scientific)对蛋白质进行定量。蛋白质(15或30μG）进行SDS-PAGE并转移至PVDF膜。在1倍的Tris缓冲盐水中用5％牛奶或5％BSA封闭膜，在室温下为0.1％Tween-20（TBS-T）1小时。将初生抗体在封闭溶液中稀释，并在4℃下孵育过夜。将膜在1×TBS-T中洗涤，并在室温下在阻断缓冲液中施加适当的HRP缀合的第二抗体。用TBS-T洗涤墨水，并用ChemIDOC MP成像系统（BiORAD）检测化学发光，临时临时净化净污染物。使用以下一抗：Lig4，DNA-PKCs和PDNA-PKCS S2056（Abcam，Cambridge，UK），β-actin和Vinculin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)和GAPDH, cleaved caspase 3, caspase 9，β-Tubulin，PCHK1-S317，PCHK1-S345，Total CHK1，PCHK2-T68或Total CHK2（Cell Signaling Technology，Danvers，MA）。使用的二级抗体是：HRP缀合的山羊抗兔和山羊抗小鼠（杰克逊免疫研究，西林，PA）。

2.6。细胞活力

将细胞在96孔白壁板（Costar，Corning，NY）中生长过夜，随后用SiRNA靶向Lig4或NT转染72小时。Celltiter Glo发光细胞活力测定（Promega，Madison，Wi）用于在转染后每种制造商的指示量化可活细胞72小时。为了评估克隆核生存期，将BT549细胞转染24小时，然后将转染的细胞接种在每平500个细胞的播种密度的60mm盘上。允许细胞附着4小时，并在37℃下在3℃下孵育7-10天，并每三天补充新鲜培养基。孵育后，用1×PBS洗涤细胞一次，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟。然后用0.5％甲醇的0.5％晶紫染色细胞2小时。将细胞用水洗涤，风干，计数≥50细胞的菌落。镀效计算为PE =（形成/添加的细胞数量）SF = (PE Lig4贫细胞/ PE NT细胞)100.对于所有测定，实验重复至少三次，每次实验中的三次重复。

2.7。免疫荧光

细胞在四孔腔载玻片上生长过夜，然后用靶向Lig4的siRNA或干扰控制(NT)转染24小时。细胞经PBS处理24小时，4%多聚甲醛固定10分钟，0.1% Triton X-100渗透1分钟，洗涤，室温下用1%牛血清白蛋白封闭30分钟。识别p-S139-H2AX的一抗(γH2AX;Abcam)在室温下封闭溶液1小时。PBS洗涤细胞，Alexa Fluor 488标记的二抗(Invitrogen)在室温下阻断溶液1小时。细胞被洗涤并安装在含有DAPI (Fisher)的延长™Gold Antifade Mountant中。图像是用蔡司Axio成像仪显微镜数码拍摄的，使用绿色和蓝色通道γH2AX和DAPI。每一种情况都拍摄了10张图像。γH2AX Foci使用与DAPI染色区域定义为兴趣区域（ROI）的DAPI染色区域量化。非DAPI染色区域用于解释背景荧光，并从每个中减去γH2AX平均强度信号值。平均强度信号γH2AX被标准化为每张图像的DAPI染色面积。

2.8。统计分析

使用GraphPad Prism（La Jolla，CA）进行所有统计分析。使用yates校正的Chi-square分析评估Lig4.肿瘤分子分类的遗传改变;使用双面Fisher的精确测试确定P值。的影响Lig4.通过单向ANOVA评估mRNA表达水平的基因剂量，并评估从左到右的线性趋势进行评估事后。通过与额外的平方/ F测试相结合的线性回归评估细胞生长随时间随时间的统计分析。除非另有说明，否则使用双尾的处理将暴露于NT或Lig4 siRNA的细胞t测试。

3.结果

３.１.Lig4耗尽会降低细胞活力

评估患病率Lig4.基础与非基础乳腺癌的遗传改变，我们使用CBIoportal询问了表征癌症基因组（TCGA）的乳腺癌患者的乳腺癌患者。放大Lig4.在Metabric DataSet中2509个样本中的所有乳腺癌中观察到的1.8％（2018年8月访问）。在分类为基础的209名患者中，百分比明显高出8.1％Lig4.与其他分子亚型的1.3%相比(图)1（a），p <0.0001）。为了确定这些基因组改变是否引起表达水平的增加，我们评估了通过TCGA使用Illumina人V3微阵列产生的mRNA表达Z分数（图1（b））.对于每个数据集，完成普通单向ANOVA以询问MRNA的平均值是否在具有基因组差异的个体之间的不同，即通过评估来自最严重的负基因变化的线性趋势（非基础的深缺失基础乳腺癌患者的浅缺失，分别为患有基因剂量阳性变化的人：扩增。这些结果的摘要在补充表中呈现1。大幅增加Lig4.在基础患者（斜率= 0.1735，P <0.0001）中观察到表达，但不是非基础队列（斜率= 0.02979，P = 0.8348），表明基础患者的mRNA水平随着增加而增加Lig4.基因剂量（图1（b））.为了探讨Lig4在乳腺癌中的作用，特别是TNBC，我们在基础乳腺细胞系中耗尽的Lig4并使用QPCR确认敲低（图1 (c)和1 (d)）和Western Blot（数字1 (e)和1 (f)）.我们评估了Lig4耗竭在敲击后72小时后对细胞活力的影响，观察到细胞活力的温度较大但显着降低（图2(一个)和2 (b)）由于单独降低细胞Lig4水平。我们雇用克隆源测定来研究Lig4贫化细胞的细胞生殖死亡[26.］.与对照细胞相比，具有耗尽的Lig4水平的TNBC细胞的存活率降低了约50％（图2 (c)）.Lig4缺失没有显著增加细胞对复制毒素的敏感性(补充图)1数据未显示)。

3.2。Lig4敲低降低细胞活力而不提高细胞凋亡

为了确定生存能力的下降是否是凋亡增强的结果，我们评估了凋亡指标。用已知可导致细胞死亡的复制毒素(数据未显示)处理Lig4耗尽的细胞:CPT (0.2μm），胡（2 mm），ETOP（10μ米)、阿霉素(1μm）或用载体（DMSO）24小时。使用蛋白质印迹进行评成的蛋白质，用于表达凋亡指示剂切割的胱天蛋白酶3和Caspase 9。观察到凋亡指示剂的水平在Lig4耗尽和对照（NT）细胞中相似（图3（c）和补充数字2A和2B.)提示Lig4单独耗尽或毒性损伤后细胞凋亡没有明显增强。我们采用细胞计数法来评估细胞增殖的变化。Lig4敲低后每24小时计数一次，持续120小时。与NT细胞相比，lig4耗尽细胞的细胞聚集率降低(图)3(一个)和3（b）），表明可能抑制细胞分裂。

３．3.Lig4防止复制叉失速

为了辨别Lig4耗尽后的细胞数是否是由复制叉动力学的改变引起的，我们使用DNA纤维测定。在Lig4耗尽的细胞中，我们观察到与对照细胞相比，被停滞复制叉的百分比增加（图4.和补充表格2）.在接受第二个胸腺嘧啶类似物之前，细胞暴露于PBS 1小时，也显示出类似的结果(补充图)3A和补充表格3.）在暴露于复制应力的细胞中，如预期的那样，观察到停滞叉数的显着增加，随着Lig4耗尽细胞的重启叉的数量与NT细胞（补充图3B.和补充表格3.）.观察到的差异可能是由于Lig4耗竭而不是通过添加复制毒素显着增强。我们的研究结果表明，Lig4耗竭影响TNBC细胞中的基础复制水平。

3.4。Lig4减少不会改变检查点激活

对复制叉延迟增加的一种解释可能是DNA损伤检查点信号的增强。Chk1和Chk2是在DNA损伤和已知的DNA损伤信号通路中通过磷酸化激活的检查点蛋白。我们评估了复制应激后Chk1和Chk2的磷酸化和去磷酸化。Chk1在DNA损伤后的两个残基上磷酸化，S317和S345，而Chk2在T68上磷酸化。用免疫印迹法评估磷酸化和总Chk1(图)5(一个)）在治疗中，NT和Lig4之间保持相似。Lig4耗尽和NT细胞具有相似的CHK1去磷酸化水平（图5 (b)）.Tig4耗竭的T68的CHK2磷酸化和去磷酸化也不变（图5 (c)和5（d））.这些结果表明Lig4耗尽导致在激活或灭活检查点信令中没有损伤。

3.5。Lig4耗尽增加了基础γH2AX水平

我们研究了由Lig4水平降低引起的未解决的持续性DSB可能损害细胞复制的可能性。H2AX是S139位点磷酸化的组蛋白变体(简称H2AX)γh2ax）响应DSB [27.］.要了解Lig4耗竭是否导致DSB的增加，我们评估了形成γH2AX聚焦于Lig4耗尽和对照细胞。转染siRNA靶向Lig4或扰乱对照的TNBC细胞用PBS处理24小时γ免疫荧光法检测H2AX。我们观察到γH2AX焦点在Lig4耗尽细胞中（图6.和补充表格4.）.增加γ在Lig4耗尽的细胞中H2AX病灶可能表明持续自发产生的未解决的DSB。

3.6。Lig4耗竭增加DNA-PKC的磷酸化

除了其作为关键NHEJ蛋白的良好作用，Lig4可能在电离辐射后S2056促进DNA-PKCs自磷酸化[28.］.我们在S2056评估了Lig4耗竭对DNA-PKCs自磷酸化的影响。具有或不带Lig4敲低的TNBC细胞用10mM HU或载体处理1小时或24小时，并在指定的处理时间后在完全生长培养基中释放2小时。通过Western Blot评估PDNA-PKCS S2056和总DNA-PKCS水平（图7（a））.我们发现Lig4耗尽的细胞显示出增加的PDNA-PKC S2056水平随着复制应力的长时间暴露，这可能导致复制叉崩溃和DSB（图7（b））.PDNA-PKC S2056的增加程度导致有限的结束处理[29.[虽然由于Lig4的衰减而无法修复现有的DSB，但导致持久性DSB。

4。结论

Lig4经常被扩增，导致基础乳腺癌患者的mRNA表达升高。虽然不是冗余的术语，大多数TNBC被归类为基础乳腺癌，反之亦然。为了评估TNBC靶向Lig4的实用性，一种预后差和缺乏药物靶标的亚型，我们在基础TNBC细胞系中击倒了Lig4水平，并观察到可行性的温和而显着降低（图2(一个)和2 (b)）和减少克隆致症生存（图2 (c)）.Lig4耗尽细胞相对缓慢增殖（图3(一个)和3（b））没有伴随增强细胞凋亡（图3（c））.此外，我们观察到增加的DNA复制痕迹百分比随着Lig4敲低细胞中的新复制叉的相关性降低（图4.和补充图  3(一个)）.综上所述，这些数据表明，Lig4缺失会影响细胞复制的基础水平。

我们评估了由于Lig4减少而降低TNBC复制的可能解释，包括超动或未能在未分发的DSB中灭活复制检查点信令和/或高程。CHK1和CHK2是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其磷酸化其他下游DNA损伤响应效应蛋白，最终促进细胞周期停滞并阻断G2 / m转换[30.那31.］.急性（1小时）或延长（24小时）后的CHK1和CHK2活化与胡锦涛暴露相似，无论敲低，表明Lig4都不调节它们的激活（数字5(一个)和5 (c)）.类似地，对复制胁迫后Chk1或Chk2去磷酸化的时间研究表明，抑制检查点激活并不依赖于Lig4(图)5 (b)和5（d））.我们评估了γH2AX焦点在Lig4耗尽和控制细胞中，因为这种后期改性是DSB的[27.］.我们观察到γH2AX焦点以下Lig4耗尽（图6.）.添加复制毒素并没有大幅增强γH2AX焦点形成在Lig4敲低细胞（未显示数据）。集体，我们的数据表明增加了γLig4耗尽细胞中的H2AX焦焦可能由于持续自发性出现未解决的DSB并且导致细胞增殖率降低。

在电离辐射后，Lig4可以在S2056中有助于DNA-PKCS自磷酸化[28.]，这种修饰导致DNA-PKC与DNA在DNA在DSB位点增加[29.］.DNA-PKCS是一个非常大的蛋白质（约469kDa），其在DSB的存在限制了最终处理因子对DNA损伤部位的访问[32.］.由于HR需要末端处理来修复，这些DSB可能优先通过NHEJ途径修复[32.］.我们在S2056评估了Lig4耗竭对DNA-PKCs自磷酸化的影响。在我们的测定中，Lig4耗竭随着复制应力的长时间暴露而增加PDNA-PKCS S2056水平（图7（a）和7（b））似乎与先前公布的结果相反，表明Lig4促进PDNA-PKCS S2056 [28.］.然而，Cottarel等人证明，虽然Lig4的废除(敲除)确实阻止了S2056的磷酸化，但正如我们的实验所示，引入少量的Lig4就足以驱动DNA-PK磷酸化[28.］.我们认为，DNA-PKCS磷酸化的这种升高表明由于Lig4敲低引起的未填充的DNA损伤。在我们的结果中，对Hu的持续接触导致复制叉崩溃导致DSB的积累，这仍然是由于Lig4耗竭导致的NHEJ介导的修复与DNA-PK无法从破碎的末端解离以允许HR介化修复[32.］.我们之前描述了DNA-PKcs在细胞对复制应激反应中的作用[10.那12.]，它们与用Lig4耗竭观察到的东西不同。这表明DNA-PKCS在Replication Fork Recovery中的作用之外，在NHEJ中的作用，而Lig4在细胞活力中的作用与其在NHEJ中的中心作用一致。我们的结果表明Lig4通过NHEJ分辨出自发DNA损伤来促进细胞存活，并通过DNA双重确保DNA-PKC的解离，以允许最终处理和HR介导的修复。

我们研究的临床结果是多方面的。这些结果表明，当DNA-PKcs被删除或抑制时，本实验室和其他实验室所证明的复制应激敏感性与它作为NHEJ蛋白的作用并不冗余，并双重提示了其他致敏机制。此外，我们的结果表明，通过降低TNBC中的Lig4水平，细胞活力适度下降，而Lig4活性的下降与电离辐射敏感性的深刻增强有关[33.］.因此，Lig4的抑制可以与FDA批准的乳腺特异性立体定向体放射疗法伽爱摄像机的治疗应用有益，该乳腺腺体伴有高（8GY），但局部化的乳腺癌治疗辐射[34.］.我们预期Lig4耗竭将增强乳腺癌治疗中电离辐射的效力。Lig4抑制的临床后果是考虑到CRISPR / CAS9介导的治疗剂的情况下指导DSB修复对HR与NHEJ的关键。具体而言，在临床上适用的同源性替代性异常基因是依赖于利用HR介导的DSB修复而不是NHEJ，并且是现代分子医学的重大重点。与与NHEJ相关的其他蛋白质相比，Lig4活性主要受到NHEJ介导的修复，使得该临床价值的靶标。因此，了解降低Lig4活动的生物学后果对于不仅在癌症生物学上通知未来的治疗性，而且对多种疾病状态进行了通知至关重要。

数据可用性

如上所述，呈现的TCGA数据来自元质乳腺癌数据集。可以通过TCGA数据门户网站https://portal.gdc.cancer.gov或虽然cbioportal http://www.cbioportal.org访问此数据。用于支持本研究结果的剩余数据可根据要求从相应的作者获得。

利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

致谢

作者想承认博士。Jac Nickoloff，Ryan Ashley，以及Chris Kemp在这个项目上有价值的投入。我们还要感谢Grace Hooks，Melissa Chavez，John Cavaretta，Christiane TSO，Prisila Ramirez，以及麦迪逊富勒斯为该项目提供帮助。本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家一般医学研究所的机构发展奖（IDEA）的支持[P20GM103451]，癌症研究进展的伙伴关系：NMSU / FHCRC，部分支持NCI GRANTS [U54CA132383至NMSU和U54CA132381至FHCRC]，以及癌症研究飞行员的牛仔队，所有这些都授予阿曼达K. Ashley。

补充材料

数字1：由于Lig4耗尽，多柔比星没有增强细胞死亡。在暴露于多柔比星（0.03,0.1,0.3,1.0,3.0,10,30,3.0,3.0,30，30,100nm）后，将Lig4耗尽和对照细胞（NT）进行克隆因测定。实验重复三次。补充图2: Lig4敲低不会增强caspase的活化。（a，b）使用蛋白质印迹在用复制毒素处理的Lig4耗尽和对照细胞中评估凋亡标记物的凋亡标记物水平和Caspase-9（1μMOXORUBICIN，2mM羟基脲，10μ0.2 M依托泊苷,μm camptothecin）或dmso。切割的Caspase-3或Caspase-9的平均强度值首先标准化为加载控制，β-微管蛋白，然后第二次归一化到载体处理的对照(NT)细胞。实验重复四次，密度测量用误差棒表示标准差。补充图3.：Lig4耗竭不会显着加剧羟基脲诱导的复制叉分流。（A，B）将BT549细胞用靶向Lig4或加糖的对照（NT）和使用DNA纤维测定来评估DNA复制的细胞。简而言之，通过用PBS（A）或10mM羟基脲（HU; B）处理，用胸苷类似物IDU和CLDU脉冲细胞。对于每种治疗，在致盲以进行治疗后，被停滞，新的和重启的复制叉。将Lig4耗尽细胞中停滞，新的和重新启动的复制叉的百分比与各种NT对照细胞进行比较（p < 0.05,p < 0.01,P <0.001）。补充表1：Lig4中的拷贝数改变与基础但不是非群母乳腺癌患者的Lig4 mRNA表达增加有关。使用癌症基因组Atlas（TCGA）使用癌症基因组ATLAS（TCGA）产生的mRNA表达Z分数由来自基底（n = 209）或非基碱（n = 2300）乳腺癌（BRCA）的患者的CBIoportal检索。通过TCGA报道的拷贝数来分层mRNA水平，并使用单向ANOVA进行比较，然后使用TUKEY的多重比较测试（N.S. =不显着，p < 0.05,p < 0.01,P <0.001）。在BASAL BRCA数据集中未报告深度删除。补充表2：关于图的统计细节4.每个治疗的每张幻灯片都是可视化的，从幻灯片的整个长度捕捉图像。表格中显示了每次治疗评分的图像数量。纤维被标记为红色(失速叉子)，绿色(新叉子)，或红+绿色(重启叉子)。列出了每次处理得分的纤维总数。停止的、新的和重新启动的分叉被表示为每个处理条件的总分叉的百分比。补充表3：关于补充图的统计细节3.。每个治疗的每张幻灯片都是可视化的，从幻灯片的整个长度捕捉图像。表格中显示了每次治疗评分的图像数量。纤维被标记为红色(失速叉子)，绿色(新叉子)，或红+绿色(重启叉子)。列出了每次处理得分的纤维总数。停滞不前，新的和重启的叉子表示为每种治疗条件的总额定叉的百分比。补充表4：关于图的统计细节6.在63X油浸下观察细胞，每个处理捕获10张图像。γ使用imagej软件量化H2AX焦点，该软件与DAPI染色区域定义为感兴趣的区域。非DAPI染色区域用于解释背景荧光，并从每个中减去γH2AX平均强度信号值。平均强度信号γH2AX被标准化为每张图像的DAPI染色面积。（补充材料）

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