抽象性

评估遗传毒理对哺乳动物细胞线作用分析方法时,我们用单细胞凝电光检测和气相色谱测量测试三种常见遗传毒理对中国仓鼠卵片的影响悬浮成型CHO电池用etoposide、blemycin和ebromy脱氧核素断片处理后用所有三种物剂检测出脱氧核素,GC-MS/MS只能检测出脱氧核素核素氧化素这表明,虽然GC-MS/MS在检测遗传毒效方面有局限性,但可用于某些有助于氧化过程的化学元毒与GC-MS/MS并用彗星剖析方法可以更有用地筛选各种化学元子并监测其他脱氧核糖核酸破坏因子

开工导 言

哺乳细胞接触遗传毒剂和电离辐射可产生多种不良效应,包括脂质、蛋白质和脱氧核糖核酸损害脱氧核糖核酸损耗与多种疾病的进化、致癌和发病相关[Huntingtonsssssssssssssssssss一号..离散辐射是另一个脱氧核糖核酸损耗源,在治疗癌症的临床实践中也广泛使用2..实验体外证据引出假设,复杂损害包括线性折损和基础损伤更难通过修复酶修复3..在这方面,关键是要有可靠的方法通过检测细胞脱氧核糖核酸所造成的损害来评估基质损耗和化学剂诱发的分片破解为此,我们比较气相色谱-质谱测量法(GC-MS/MS)和从三种常用遗传毒剂中检测DNA损害的彗星解析法:etoposide、blemycin和ebromysonate

Etoposide与d-gluce衍生物并发癌症细胞比正常细胞受更多影响,因为癌症细胞分治速度快配药处理结果产生脱氧核糖核酸合成错误4-6..

白素硫酸甘油抗生素诱发脱氧核糖核酸分片试管内依赖氧和金属离子富集作用机制不完全理解,但人们认为blemycin切片金属离子(主要为铁)并组成伪兹元体,它与氧产生超氧化和氢氧基质发生反应,可诱导基础损耗和分片破解[7-九九..

乙基甲烷富集物是一种潜在的致癌复合物,通过核素代换引起点变异EMS乙基组通过算法对guanine基础响应编组O级⁶乙基九脱氧核糖核酸聚合物代之以甲状腺O级⁶乙基九结果,在复制期间原生G:C基对变换A:T10,11..

数例解析基因组脱氧核糖核酸其中包括使用单细胞凝胶电阻测量全细胞脱氧核糖核酸-碱和中性,微核检测,使用毛片或凝胶电阻测量单细胞分片脱氧核酸气相色谱-质谱和液色谱-质谱均单版或同步版用于测量多项氧化修改脱氧核糖核酸产品,如糖和基底损耗8,5 -循环2 -脱氧核素化基联想损耗 脱氧核素核素和脱氧核素交叉链路试管内并维沃.彗星剖析是一种常用方法,用于检测脱氧核糖核酸的临床相关水平,形式为线断裂和碱性实验室12-14..质谱测量系统提供结构证据解析并使用稳定同位素标签模拟解析器内部标准(同位素稀释系统)实现精确量化

研究中,我们比较彗星检测和GC-MS/MS能力,用三种常见化学元子处理后检测培养哺乳动物细胞DNA结构变化:etoposide、blemycin和EMS选择这些代理物是因为它们都已知引出脱氧核糖核酸,但由不同的作用和毒性机制产生在这方面,我们选择每种物剂的具体接触条件,已知这些物剂产生重大的遗传毒性,最小损耗细胞生存能力15-17..仓鼠卵巢细胞悬浮培养期间接触三种物剂,并用相同样本组两种分析技术测量脱氧核糖核酸损害程度strand分解通过彗星解析量化,并用质量GC-MS/MS量化身份和水平引出脱氧核糖核酸基值使用碱性彗星检测法而非中性彗星检测法,因为碱性版本有效检测单层和双层中断法FPG修改后彗星已被证明对检测氧化基值有用,但我们选择GC-MS/MS用于此目的,因为它对数项氧化产品的结构和数量提供直接化学分析。在这方面,我们想使用碱性彗星分析法具体比较脱氧核糖核酸分片式(单倍)与GC-MS/MS检测基值损耗通过比较碱性彗星检测到GC-MS/MS,我们显示对脱氧树枝破损和脱氧核糖核酸损害的配对测量使用这两种方法,可深入了解毒素产生的这类损害比例,毒素作用机制千差万别并有可能通过电离辐射产生

二叉材料方法

2.1.素材类

自由式悬浮中国仓鼠卵巢从Invitrogen获取(Carlsbad,CA,USA)。自由式CHO表达式介质取自Invitrogen号12651并补充L-glutamin使用前最终浓度8mol/LEtoposide从Sigma-Aldrich公司获取Cat.号E1383-25mgStLouis,MO,USA)白素硫酸盐号B8416和乙基甲烷号m0880-1g)从Sigma-Aldrich公司获取Calfymus脱氧盐、磷酸钠单基和磷酸钠二基从Sigma-Aldrich公司购买4,6-Diamino-5-formamidopyrimidine-[¹³C¹⁵N级₂fapyAde-¹³C¹⁵N级₂), 2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine-[¹³C¹⁵N级₂fapygua-¹³C¹⁵N级₂8-hycryadenine-¹⁵N级₅8-OH-Ade-¹³C¹⁵N级₂), 5-hydroxy-5-methylhydantoin-[¹³C¹⁵N级₂5-OH-5-MeHy¹³C¹⁵N级₂8-Hiblexy-2 -deoxyguanosine-[¹⁵N级₅8-OH-dgu¹⁵N级₅8-xo-78二水力2 -deoxyguanosine-[¹⁵N级₅setope实验室8-Hydroxyguanine-[¹⁵N级₅8-OH-Gua-¹⁵N级₅8-xo7 8-二水合九-¹⁵N级₅8-xogua-¹⁵N级₅8-Hycroxy-2水解 -deoxyguanosine-[¹⁵N级₅60% )140摄氏度为30分钟并发lyoblication后期8-OH-Gua¹⁵N级₅10mol/L NaOH使用前溶解esherichia大肠杆菌状仿DDGglycosyraceesherichia大肠杆菌EndoIII从Trevigen购买(Gathersburg,MD,USA)。

2.2.单元自由式CHO-S单元

自由式悬浮 CHO-S细胞成长 电池/毫升250毫升旋转瓶号4500-250)37摄氏度、90%相对湿度和8%CO₂.单元可行性计数使用Beckman/CoulterVi-Cell XR计数器处理后重复执行所有手机可行性计数显示98.1%或以上读数除800分的环管系统准备华府g/l96%

2.3Etoposide处理

四种旋转栅栏,每片100毫升悬浮 单元格/mL编译eposide溶液(10 mg/m单元格[0、1.5、3和6]华府g/ml为1h37摄氏度轨迹摇动器,90%相对湿度和8%CO₂如下:时0,60华府LDSO添加控制瓶#1,15华府L存储etoposide+45华府LDSO添加到2号瓶中华府Lsset+30华府LDSO添加到3和60华府L存储解决方案加到4瓶1小时后,从孵化器中去除瓶子并放入冰层Vi细胞计数 Aliquot检查从每瓶中去除剩余悬浮转至50mL管并分解4摄氏度细胞用冷介质悬浮并放入冰层,同时进行Vi-Cell分析(15分钟)。单元格再次滑动,超级目录被丢弃,电池再次悬浮冷介质(CHO表达式中型+10%DMSO)。1 ml单数细胞密度 细胞/ml编译快速冷冻并存储在-150摄氏度对彗星检测和GC-MS/MS

2.4.布莱密宁处理

四种旋转栅栏,每片100毫升悬浮 单元格/mL设置Bleomycin溶液(5 mg/m单元[0,0.5,1和2]华府g/ml为1h37摄氏度轨迹摇动器,90%相对湿度和8%CO₂如下:时0,40华府L水加到控制瓶#1,10华府L存储Blemycin解法华府L水加到二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉二叉华府L存储blemycin解析华府L水加到3瓶和40瓶华府L存储Blemycin解析法添加到blask#41小时后,从孵化器中取出瓶子并放入冰层逐瓶消除静电计数剩余悬浮转到50mL管上,滑动并重悬冷介质和1mlaquot完全像前文描述的etoposide

2.5EMS处理

四种旋转栅栏,每片100毫升悬浮 单元格/mL编译EMS储量解析法(1.206g/mL)单元格[0,400,800和1,600]华府g/ml4h37摄氏度、90%相对湿度和8%CO₂如下:0时,控制瓶1,33.2没有添加华府ESS储量解决方案L添加到2瓶中,66.3华府L储量解决方案添加到3和132.7华府ESS储量解法添加到4瓶4h后,从孵化器中取出瓶子并加冰逐瓶消除静电计数剩余悬浮转到50mL管上,转落并两次悬浮冷介并按前文所述为etoposide和blemycin制作了1mlaquot

2.6彗星Assay

脱氧核糖核酸单层和双层破解以及碱性实验室均按前文描述的碱性彗星剖析测量18号..程序类似于多前研究使用法19号-22号..简言之,每口井20微秒滑动(Trevigen公司、MD公司、USA公司和Cat公司)号425220001填充华府L完全混合悬浮细胞低熔化agarose 单元格/ml)幻灯片以三重形式搭建,每次处理集中使用5口井30分钟冷细胞解析法注入幻灯片后(Trevigen公司Cat号4250-01001室温度20分 )碱性破解法(200mol/L NaOH,1mol/LEDTA和 )4摄氏度对装满碱性解析法的彗星AsssayES罐体(Trevigen公司、MD公司、USA)进行30分钟演练at 21V(1V/cm)幻灯片用蒸馏水冲刷,固定5分钟70%乙醇,干燥后4摄氏5分钟SYBR绿色I4250-050-05稀释1:10 000TE缓冲pH7.5

2.7微镜像分析

彗星幻灯片分析前文中描述23号..简言之,用Olympus系统模型BH-2显微镜通过显微镜可视化幻灯片,装有SYBRGreenI适当光滤器集(460纳米振荡和560纳米释放波长Chroma4902ETGFP)。LUDLMAC6000自动化级和光度Snapcool HQ2单色CCD相机使用Niken元素BR软件控制4.20,Nikon Inc.)尾部综合强度和百分比DNA使用imageJ测定1.47v,NIH和CometScorePro1.01.44TriTekCorp.VA应用下列方程软件 去哪儿 并 个人像素强度介于慧星图像头部和尾部区域大约100个细胞在每个处理级别计算三次复制

2.8GC-MS/MS分析处理单元脱氧核糖核酸

脱氧核糖核酸使用高盐提取法从处理细胞提取24码..方法基础程序发布前25码..简言之,细胞离心洗两次磷酸盐缓冲saline(PBS)并用新制解析解析解解解解解法注入18Hmgs(2 mg/ml孵化后采样放在冰上并添加饱和纳氏6.ml/L装有脱氧核糖核酸的超级目录仔细编译,并增量96%乙醇获取可见脱氧核酸离心机脱氧核糖核酸粒子在冷70%乙醇离心机中洗两次,其余乙醇因吸尘脱色而蒸发脱氧核糖核酸样本用TE缓冲区溶解(pH8.0),内含0.2 mg/mlRaseA/T1,在37摄氏度时孵化1h,在冷96%乙醇中再次沉淀,并汇入1.5ml管中收集脱氧核糖核酸粒子再次洗两次乙醇70%,同前蒸发后隔夜溶入0.5mL分解水样本脱氧核糖核酸浓度华府g/华府L)后用吸附度测 纳诺多洛普一号并重引用为50华府g供GC-MS分析

2.9GC-MS/MS测量修改式脱氧核糖核酸基础

四重式样本含50华府g从etoposide、blemycin-和EMS处理的细胞中提取的每一种基因组脱氧核糖核酸均以静水解析,通过三甲基合成并分析分析,使用脱氧核酸提取和同位素稀释GC-MS/MS方法前几次研究详解26-29..40Gy伽马辐照脱氧核糖核酸样本用作正控件(例如识别修改脱氧核酸基数)。

多重反应监测模式GC-MS/MS分析基于修改先前开发的选离监测模式GC/MS方法30码..稳定同位素标签仿真修改脱氧核糖核酸基础7000串GMS/MS系统用正离子模式操作电子离子化模块化系统由7693自动取样器、7890AGC炉和7000系列三重质量分析器组成,为MS1和MS2配置最宽分辨率详解、大规模转换等见辅助材料最终结果量化数报告/10⁶脱氧核糖核酸基础

2.10统计分析

所有统计分析,包括方法、标准误差和标准偏差和不确定性均用GreaphPad Prism6.0进行不确定性与控件比较使用无偏单尾量计算 -测试表2一号内含彗星分析结果和表2内含GC-MS/MS分析结果

3级结果

3.1.彗星分析

图1(a)显示典型慧星分析数据图片 从细胞处理 递增聚环管系统尾部中%脱氧核糖核酸测值并绘制典型直方图(尾部X轴比例为0-100%脱氧核酸),图中显示1(b).

图2显示盒和小白分析块显示尾巴中测出增加%脱氧核糖核酸的细胞,处理中浓度增加的etoposide、blumycin和EMSEMS处理造成重大DNA损伤(最高处理级80%)。etoposide和blemycin数据显示损害较低(30%-50%),但慧星分布更多异性,这反映出响应这些处理方法的生物可变性提高。为此,平均三组复制彗星数据以获取足够的统计资料势在必行。图3显示平均方式图 3集复制数分析使用同组etoposide、blemycin-和EMS处理细胞图图显示相同趋势2.

表2一号描述三次复制慧星测量统计分析并行执行,使用同组etoposide、blemycin-和EMS处理细胞平均三种个人方式和标准偏差为三种方法为每种处理级别确定彗星剖析同日并行使用同组处理细胞,结果反射单个慧星测量之间的差异不确定因素 值对数etoposide和blumycin最低浓度保持高位,但在高浓度下低得多环管系统处理的不确定性仍然很低( )集中测试

3.2GC-MS分析

样本含50华府g从etoposide、blemycin-和EMS处理的细胞中提取的基因组脱氧核糖核酸用同位素稀释GC-MS/MS法消化分析8-OH-Gua、Fapygua、5-OH-Meura、FapyAde、5-OH-5-MeHyd、5-OH-Cyt、5-OH-Ura和8-OH-AdeS1)Bleomycin是唯一能显著提高脱氧核糖核酸损耗水平的物剂图中S1前三大损耗(8-OH-Gua、Fapygua和5-OH-Meura)显示Belomycin呈上升趋势,而Etoposide和EMS处理后则没有任何显著增加。其余损伤(FapyAde、5OH-5-MeHyd、5OH-Cyt、5OH-Ura和8OH-Ade)在用etoposide、blomycin和EMS处理后没有明显增加,图中也显示S1.图中显示由blemycin生成三大损耗(8-OH-Gua、Fapygua和5-OH-MeUra)的方法和标准偏差4.

图中显示4,Fapygua测量结果最小变异和最大增量相对于控件8-OH-Gua测量显示高得多变异和低增量未处理控件中的损耗略高(1.0/10)⁶脱氧核糖核酸基础)表示脱氧核酸隔离期间8-OH-Gua损耗增加不过,此处使用GC-MS/MS法证明可靠并可复制测量8-OH-Gua级别,而替代样本编程程序加LC-MS/MS31号..5-OH-MeUra测量中再次观察到浓度上升趋势,尽管高变异和低统计意义(表)。2)

表22显示GC-MS/MS处理分片后测量的统计分析表中包括平均数脱氧基数/百万基数,包括标准误差和平均值偏差控件 值函数处理集中8-OH-Gua和5-OH-Meura最低处理集中度单测值低值 )对比控件测量值最高处理富集度较高 并 )观测到使用Fapygua损耗处理作用 )获取

4级讨论

化学物剂供临床使用,特别是用于对癌症细胞的毒效,因此必须开发敏感解析监测其效果在这方面,已广泛使用彗星剖析测试遗传毒剂对哺乳动物细胞脱氧核糖核酸线断裂的影响在当前研究中,我们测试三种常用遗传毒剂-etoposide、blemycin和EMS-已知有不同作用机制-以确定脱氧核糖核酸分解形式是否与这些代理物基损耗相关联这样比较对活细胞有效, 我们选择处理条件 每种代理

发现慧星检测DNA线破解 由所有三个测试代理EMS生成高得多响应 条件我们选择处理环管系统选择的集中范围基于先前发布的研究报告,这些研究显示其在产生分片中断[17产生细胞生存能力不足2%环管系统生成线间拆解最大效果(接近90%),尽管DNA基质高浓度,但没有产生可检测到的损耗增加在本案中,生成线性分解器和核基由该物剂氧化之间没有观察到相关关系maybe,使用一种更强电动代理物或芯片可产生核基氧化性,GC-MS/MS可检测Bleomycin是唯一产生可检测基础损伤的代理物,这可能是由于拟议机制导致生成自由基

Topo异构体二函数解析脱氧树枝消除etoposide诱导的损耗与已知etoposide机制一致,该机制不与脱氧核糖核酸基数反作用4..这些信息与GC-MS/MS检测到的未加修改脱氧核糖核酸基

EMS行为生成变异 通过guanine算法组成基础损耗O⁶乙基九但由于目前分析方法格式不允许检测或量化对脱氧核糖核酸基体的变异形成常导致脱氧核糖核酸片段,正如我们在研究中观察到的那样Bleomycin则可能切片金属离子并起伪增律作用,与氧产生自由基10..

约10⁴至10⁶脱氧核糖核酸每天在每个活性哺乳细胞中诱发损耗,主要归因于自发反应水和自反应氧物种类(ROS),这是正常代谢期间生成的,在脱氧核酸合成期间复制错误或化学或电离辐射等外生因素[32码..如果不能修复,这些缺陷可导致DNA破损,形式为变异、双层破解和最终染色体重排列和移位导致癌症和细胞死亡单串分机相对容易用单片修复,因此分分钟修复t级_1/220分钟)双串分机,特别是非同差端连接时,难修复多得多,耗时长多多,并更容易出错三十三..与增强脱氧核糖核酸链分解法相一致,我们在EMS处理后观察到,用彗星解析测量

氧化诱导损耗脱氧基可由ROS攻击生成(主要为hyxy^⋅核酸池中纯核酸和完整双工式脱氧核糖核酸因关宁拥有最小氧化潜能34号氧基攻击往往导致8-OH-DGTP与高诱导损耗8-OH-Gua并发九九,29..8-OH-Gua推广 转移变异还可能导致流程分片10..脱氧核糖核酸基损耗(8-OH-Gua)和脱氧核糖核酸树枝破解分别见诸于我们的GC-MS/MS和get解析测量中,这些测量后用blemycin处理尽管彗星分析显然敏感度较高,但在blemycin方面,GC-MS/MS和get解析都是检测脱氧核糖核酸损害的可行方法。

修复部分脱氧核糖核酸可以通过基础切片修复实现受创网站总体结构基本完整化,多步进程通常快速展开,效率高忠度优于双层中断修复三十三,35码..含有单串和双串分解的脱氧核糖核酸可能不包含大量脱氧核酸基值损耗EMS生成高水平脱氧核糖核酸片段,按彗星剖析测量,没有显示脱氧核糖核酸基值的显著增加,GSMS/MS表示这一点正说明原因。此外,BER还可能降低脱氧核糖核酸基值处理水平基于这些原因,彗星剖析在检测环管系统诱发的脱氧核糖核酸损害方面会更加敏感使用etoposide处理还增加脱氧核糖核酸链破解,但不会增加脱氧核糖核酸基值代理干扰脱机复制脱氧核糖核酸,阻截分片断片,与blemycin不同,不具有切铁能力,这种能力可催化ROS生成基质损耗双向分析脱氧核糖核酸断裂和基质损坏后通过辐射处理评估生物危害和脱氧核酸修复潜力[2,3..

5级结论

GC-MS/MS总体分析遗传毒性的关键工具然而,在实验条件下,它有限检测化学元毒效应,如etoposide和EMS然而,对于blemycin等特定物剂,GC-MS检测基础损伤可能优于获取精确量化实验条件下 彗星测序显示 有效检测出所有三种物剂 造成的DNA损伤与GC-MS/MS并用,彗星剖析将有益于筛选各种其他化学元子,如cisplatin,并深入了解复杂DNA损耗机制

数据可用性

辅助数据报告结果见提供的补充材料

披露

某些商业设备、器件和材料在本文件中识别,以尽可能完全说明实验过程在任何情况下,识别特定设备或材料均不表示国家标准技术学院推荐或认可,也不表示材料、工具或设备必然是最佳可用目的

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突

感知感知

感谢DrsMiral Dizdaroglu和Pawel Jaruga使用实验方法和设备并提供帮助建议

补充素材

图S1:全GC-MS/MS数据比较脱氧核糖核酸通过etoposide、blemycin和EMS诱导前三大损伤(8-OHgua、Fapygua和5-OH-Meura)显示Blumycin(bleo)呈上升趋势,而Etoposide(etopside)和EMS(ems)处理后则无显著增长其余损耗(FapyAde、5OH-5-MeHyd、5OH-Cyt、5OH-Ura和8OH-Ade)在用etoposide、blemycin和EMS处理后没有明显增加数据显示为4类复制的平均值和标准偏差高山市补充素材)