疫苗疫苗疗效效果H.A。anatolicum，rhaa86在原核表达系统中表达 - 188bet体育t,188bet投注网站,188d博金宝官网

摘要

在蜱虫综合管理模式下，利用蜱虫疫苗控制蜱虫和蜱虫传播疾病已被证明是有效的。为了控制哈。anatolicum，BM86 Orthogholog哈。anatolicum以融合蛋白的形式在大肠杆菌作为大肠杆菌-Pethaa86。RHAA86的分子量为97kDa，具有19kDa的硫蛋白蛋白的融合标签。表达蛋白质的表征免疫，评价疫苗疗效。经过120小时的挑战后，只有26％的蜱虫可以成功喂食免疫动物。除了饲料百分比显着降低，显着降低49.6毫克;记录了对食用女性的重量，与对照动物喂养的女性进行了比较。产卵后，显着减少68.1毫克;以免疫动物为食的蜱与以对照动物为食的蜱在卵团中有明显的差异。雌虫数减少率为73.8%，平均卵重为31.3%，成虫数减少率为15.8%，免疫原效果为82.3%。研究结果表明，开发以rHaa86为基础的疫苗作为蜱种综合防治的组成部分是可能的。

1.介绍

three-host蜱虫,Hyalomma a。anatolicum，是印度侵扰牛，水牛，羊和山羊和传输中最广泛分布的蜱虫种之一Theileria Annulata，T.Fuffeli，T. Lestocardi（t .腋毛）[<一个href="#B1">1，<一个href="#B2">2］.预测的印度热带牛结核分布以及处于危险中的牛和水牛数量有充分的文献记载[<一个href="#B3">3.］.最近，据粗略估计，控制蜱虫及其传播的寄生虫的成本达到4.415亿美国人/年度。除了蜱虫蜱的势势之外，蜱虫对牲畜生产的显着直接效果需要以环保的方式开发蜱控制方法。

在印度蜱控制专注于反复直接在宿主动物上施用杀螨剂。在大多数情况下，在21至30天后重复涂抹杀螨剂的施用。该方法具有局限性，包括开发杀螨剂，环境污染，食品农药残留，以及开发新农药的费用[<一个href="#B4">4］.其他有希望控制蜱虫的方法是使用抗蜱虫疫苗[<一个href="#B5">5- - - - - -<一个href="#B7">7］.尽管针对牛蜱的蜱虫疫苗商业化存在一些问题，牛蜱属microplus［<一个href="#B7">7]，目前的蜱虫疫苗(TickGARD Plus和Gavac)在过去十年的成功清楚地显示了它们作为一种有效控制蜱虫方法的潜力[<一个href="#B8">8］.

如果是哈。anatolicum，一些潜在的抗原已被识别并测试以对抗实验性挑战感染，Ghosh等人对该课题进行了综述[<一个href="#B9">9但是，这项工作还没有达到研制抗疟疾疫苗的水平哈。anatolicum．另一方面，尽管Bm86的同源物在哈。anatolicum［<一个href="#B10">10.，以BM86为基础的异源疫苗对实验性挑战的疗效有限哈。anatolicum．最近，Bm86与哈。anatolicum已克隆并表达在毕赤酵母属pastoris被发现对同源挑战侵扰具有保护作用[<一个href="#B11">11.］.然而，重组蛋白的表达量较低。本实验以提高表达水平和减少纯化步骤为目的，克隆并表达Bm86同源基因哈。anatolicum在原核表达系统中，分析表达蛋白对同源攻击侵扰的保护效果。

2.材料和方法

２.１.兔子

新西兰大白兔，体重约1 - 1.5 kg，取自伊扎特那格尔市IVRI实验室动物资源区。饲养于寄生虫学科小动物舍消毒笼内，并进行饲养自由。兔子用于饲养焦annulata免费的哈。anatolicum也能产生特定的抗体。

2.2。交叉养育牛犊

十三只雄杂交小牛(牛Xb . indicus在研究中使用了10到12个月。所有这些交叉繁殖的小牛在研究所的牲畜管理部门采购3-4个月，并在该司的蜱虫证明动物饲养设施中维护。维持实验动物的蜱天真状态。实验动物根据委员会规定的批准指南维持，以控制和监督动物（CPCSEA），法定印度机构的实验。

２.３.实验室饲养的t . annulata感染免费哈。anatolicum

均匀的殖民地哈。anatolicumIzatnagar分离物在过去15年一直保存在寄生虫学司昆虫学实验室[<一个href="#B12">12.］.简单地，用健康的新西兰白兔饲养蜱。为避免动物应激，6-8只兔子同时饲养，每个饲养周期使用2只兔子。

为了捕食大型动物，在寄生虫学部门的防蜱防蝇棚里，杂交的公犊牛从出生初期就被饲养。的t . annulata通过对Giemsa染血涂片的定期检查来确定小牛的自由状态。

的塞得满满的哈。anatolicum采集蜱类，鉴定蜱类，并将蜱类饲养在用薄布覆盖的玻璃管中，用橡皮筋固定。玻璃管被放在那里温度和85％相对湿度（RH）为产卵。完成产卵后，死亡女性哈。anatolicum从玻璃管中除去。幼虫在新西兰白兔上喂食，其中幼虫蜕皮（在兔模型中）哈。anatolicum表现为2-host tick [<一个href="#B12">12.］.收集并保持收集的若虫。新鲜孵化的成年人保持不断过的7天，并被释放t . annulata免费的男性交叉养殖小牛。每天检查耳袋，收集喂养的成人，清洁，称重，标记，在玻璃管中单独留在温度和85％Rh用于排卵。

２.４.Haa86基因的RT-PCR扩增

来自鸡蛋的总RNA哈。anatolicum采用RNeasy总RNA分离试剂盒(Qiagen)分离。引物根据已发表的序列信息(AF347079)自行设计。设计了具有BamHI酶切位点(HF2-)的正向引物(HF2)CGGC ggatcc TTG TTC GTT GGC GCT att TTG CTC at，设计反引物(HR2)KpnI和XbaI (HR2-CCC GGTACC TCTAGA TGC AAC GGA GGC GGC CAG TAA CAG GA)，用于后续PCR产物的克隆。一个50建立L逆转录反应。最初,25.0总RNA (20g）在RNA储存缓冲液中和0.5 将L HR2（100mP）的L在DepC处理0.2mL PCR管中混合并保持在10分钟。到上述混合物10L的Mu-MLV逆转录酶缓冲液(5X)(Invitrogen)Lα抑制剂（2个单位）（Invitrogen）和10 L的dNTP混合物(每个10 mM)，并保持在5分钟。cDNA合成是在2L的Mu-MLV逆转录酶(400单位)(Invitrogen)1小时。通过将反应混合物保持在逆转转录酶灭活逆转录酶10分钟。一个25L PCR反应采用10X PCR buffer (MBI-Fermentas)，其中包含2.5 mM Tris HCl ph8.3, 2 mM MgCl₂， dNTP各10 mM，引物HF2和hr2,4各20 pm第一链cDNA溶液的L和热启动Taq DNA聚合酶(MBI-Fermentas)的2个单位。这种混合物是在热循环器(PTC-200, MJ研究)与以下循环条件:初始变性在5分钟，进一步30周期1分钟，1分钟和两分钟，最后一次延长到10分钟。

2.5。克隆HA86基因和测序

PCR产品（2 g）和表达载体pproExhtb（寿命技术）与Bamhi和Xbai进行双限制酶消化6个小时。消化的PCR产物和质粒载体均在1％琼脂糖中溶解，并在50中使用巫术SV凝胶和PCR清洁系统（PRomega）从凝胶中洗脱 L核酸酶游离水。一个5在1％琼脂糖中脱离洗脱的消化的PCR产物和质粒载体以及DNA梯子100bp加（MBI-FERMENS），通过在Syngene凝胶文件系统中通过密度测定来计算DNA的浓度。用10x连接缓冲液（10mM Tris-HCl，pH 7.5,10mM MgCl建立连接反应₂，0.1mg / ml BSA，0.5mm ATP），200ng消化载体（PProExHTB），70ng消化的PCR产物和1单位的T4 DNA连接酶并孵育过夜。连接的DNA被转移到主管中大肠杆菌DH50.1 M CaCl处理细胞₂采用热休克法，根据蓝/白菌落选择和氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆[<一个href="#B13">13.］.通过菌落裂解，菌落PCR和质粒萃取和限制酶消化来证实重组菌落。具有1965bp Haa86基因的质粒被称为pproha86f。插入件的股线两者都被Dideoxi链终止方法对。BM86 Ortholog的核苷酸序列（ORF）信息哈。anatolicumIzatnagar孤立（加入编号EU665682）及其推导的氨基酸序列与现有的序列信息viz对齐。，BM86 Ortholog哈。anatolicum卢迪亚纳分离物(原产于旁遮普邦)AF347079)和Bm86的b . microplus(澳大利亚)(加入。M29321)使用基因工具1.0版本。

2.6。通过PCR去除信号序列和C末端锚定序列

通过PCR将推测的信号序列和c端锚定序列从Haa86的ORF中删除。前向底漆(HF3)是自行设计的EcoRI限制性位点(GAATTC) (HF3-CGGC GAA TTC GGT AGA GAG GAT GAT TTC GTG TG)，设计反引物(HR4)XhoI (CTCGAG) (HR4 -CCC CTC gag TGT TGC TTC TGT agt TGC TTC t)，用于后续PCR产物的克隆。一个25L PCR反应采用10X PCR缓冲液(Ambion)，其中含有2.5 mM Tris HCl ph8.3, 2 mM MgCl₂， dNTP各10 mM, HF5和HR3各20 pm, 1.5L: 1:50稀释pPROHA86F DNA(模板)，2单位SuperTaq DNA聚合酶(Ambion)。该混合物在热循环器中以下列循环条件孵育5分钟，进一步30周期1分钟，1分钟和两分钟，最后一次延长到10分钟。

2.7。原核表达载体pET32a (Novagen) PCR产物的克隆

用EcoRI和XHOI消化PCR产物和载体PET32a。将消化的DNA连接，转化和克隆大肠杆菌BL21pLys细胞(Novagen)。重组或转基因大肠杆菌基于氯霉素和氨苄青霉素抗性选择BL21plys。得到的质粒构建体被指定为Petha86，并将克隆指定为大肠杆菌——pETHA86。PNovagen．从重组质粒中提取Haa86基因大肠杆菌通过用限制酶生态和XHOI消化来证实克隆以释放插入物。随后，还通过菌落PCR确认插入物的存在。

2.8。表达的研究

在氯霉素存在下将所选克隆3-4小时生长（34 g / ml）和氨苄青霉素（100 g/mL)，直到培养物在600 nm波长处的吸光度值大于0.6。用1 mM IPTG诱导培养，IPTG诱导后培养6-7小时。样品在10000 X g/10分钟旋转，上清液用8% SDS-PAGE和蛋白MW标记(Bangalore Genei)进行分离。最佳表达克隆经Ni-NTA亲和层析纯化。诱导培养物按10000 X g/10分钟成球。球团与裂解缓冲液(8 M尿素，100 mM NaH)混合₂宝₄，10 mm tris pH 8.0）并在连续摇动下孵育1小时。裂解物在10000×g / 10分钟内旋转。用Ni-NTA树脂（QIAGEN）加入上清液100 L / 1 mL裂解液和10-20mM咪唑并使其结合。将混合物装入小塑料柱（Amersham）中，用10ml洗涤缓冲液（8米尿素，100mm NaH洗涤₂宝₄，10 mm tris ph 8.0）。用洗脱缓冲液洗脱rhaa86（100mm nah₂宝₄， 10 mM Tris, 8 M尿素，pH 4.5)。

2.9。密度测定法测定蛋白质浓度

rhaa86的彩带强度[<一个href="#B14">14.与SDS-PAGE中分解的不同浓度BSA的带强度进行了比较。将分离的凝胶储存在Syngene Gel文档系统中，并且Syngene软件用于蛋白质浓度的比较测定。

2.10。免疫印迹与抗组织和抗BM86抗体。

在还原条件下，在8％SDS-PAGE中在8％SDS-PAGE中将适当浓度的RHAA86分解并转移到PVDF膜中。将膜条与一抗抗体分别温育（小鼠抗戊脂组氨酸IgG（QIAGEN）1％BSA和兔抗BM86抗体（Hyperimmune Sera）稀释用脱脂牛奶在PBST中稀释2小时，室温。在PBST中洗涤5次后，条状细胞在二抗(Anti-mouse IgG- HRPO (Santa Cruz))中孵育。在PBST和山羊抗兔IgG-ALP（Sigma）中1％BSA稀释分别用1%脱脂牛奶在PBST中稀释，室温下2小时。用PBST再次清洗膜条，随后在合适的底物溶液(10ml Tris生理盐水(pH 7.6)中孵育。6毫克轻拍10. L 30% H₂O₂和10ml碱性磷酸酶缓冲液（pH9.5）100年L NBT库存解决方案100年L BCIP库存解决方案)。将膜条置于蒸馏水中，反应就停止了。

2.11。免疫和挑战实验

杂交小牛()，随机分为两组，每组5只。用等体积的佐剂(10% Montanide 888矿物油)使冷冻的rHaa86完全乳化。第1组所有动物接种400G on Rhaa86在第0天肌肉内，400 第30天和第100天G在第60天。在同一天用相同的佐剂接种相应的对照动物。每个小牛（第1次，第2组）在第97天发酵后97日挑战，其中五十个未感染的两种性别的成人（男性和女性）比)，耳袋法。记录挑战后的昆虫学参数[<一个href="#B15">15.］.

(我)每只动物体内充血的成年雌蜱数量下降。（ii）掉落的被收录的蜱虫单独称重。(3)将充血的雌蜱孵化产卵，并对卵团进行称重。(iv)DT % 100(1式中DT%为雌性减少的百分比，其中NTV为组1动物中雌性数量减少的百分比，NTC为组2动物中雌性数量减少的百分比。（v）做% 100(1(PATV/PATC)，其中DO%为卵平均重量减少的百分比，PATV为饲喂组1动物的雌性卵平均重量，PATC为饲喂组2动物的雌性卵平均重量。(vi)%博士 100(1PMTV / PMTC），其中Dr％是成年女性的平均重量的百分比，PMTV从第1组动物掉下的成年女性的平均重量，以及PMTC从第2组动物掉下的成年女性的平均重量。(七)E %100 (1(阴极射线管CRO）]，其中e％是抗原的功效，CRT是成年女性NTV / NTC的数量的减少，CRO是蛋铺设能力，Patv / Patc（Patv，鸡蛋的平均重量的鸡蛋喂食鸡蛋的平均重量在第1组的动物上/ Patc，对第2组动物喂养的女性蛋的平均重量。

2.12。酶联免疫吸附测定

在蜱攻击前和蜱攻击后每隔一段时间，无菌采集所有犊牛的血液样本。血清被分离，报价并储存在．最初用棋盘格滴定法来优化试剂。优化后，将洗脱的抗原以4g/mL，保持为过夜。用PBST洗涤三次后，在室温下用5％非牛奶封闭孔2小时。三次洗涤后，稀释一抗原发性抗体在1% PBST中使用，在4个重复的孔中使用，并在RT中保存2小时。洗涤后，使用二抗(抗牛过氧化物酶偶联抗体，Sigma化学公司，美国)稀释用1% PBST浸泡2小时。反应在50秒时停止每孔3N HCl，用酶标仪(Tecan-Sunrise，奥地利)记录吸光度，取平均OD值₄₉₂一式三份的样品。

2.13。统计分析

免疫动物和对照动物的平均值的显著差异用学生的值来确定以及(<一个href="#B16">16.］.

结果

3.1。用Haa86基因片段构建细菌表达载体

用HF2和HR2引物进行RT-PCR扩增的Haa86基因片段大小为1965 bp。经基因确认后，将该片段克隆到pPROEXHTb载体中，获得构建物pPROHA86F。序列长度为144 bp终点距终点96 bp从BM86 Ortholog的ORF中删除结束哈。anatolicum通过用引物HF3和HR4进行PCR。在表达载体中克隆缩短的HAA86 ORF，其尺寸为1755bp，并将所得质粒构建体指定为petha86，并将克隆指定为大肠杆菌-pETHA86。从重组质粒中提取Haa86基因大肠杆菌克隆经EcoRI和XhoI酶切后释放。1.755 bp基因通过酶切反应释放(图)<一个href="//www.nickgirls.com/journals/jpr/2009/fig1/" target="_blank">1）.利用pET-32a表达载体和重组载体在体外表达Haa86大肠杆菌菌株BL21（DE3）帘布层表达系统。亲和纯化的rhaa86在8％SDS-PAGE上迁移为97kDa蛋白，与预期的分子量一致，考虑到表达载体产生与19kDa硫蛋白蛋白蛋白融合的重组蛋白（图<一个href="//www.nickgirls.com/journals/jpr/2009/fig2/" target="_blank">2）.经Ni-NTA树脂纯化后，SDS-PAGE显示其纯度大于98%。

当用小鼠抗组氨酸抗体检测转移的蛋白时，抗组氨酸抗体与rHaa86反应强烈，约为97 kDa(图)<一个href="//www.nickgirls.com/journals/jpr/2009/fig3/" target="_blank">3.）.同样，抗bm86抗体与rHaa86蛋白反应强烈。用对照兔血清检测含rHaa86的PVDF时未见反应(图)<一个href="//www.nickgirls.com/journals/jpr/2009/fig4/" target="_blank">4）.在较低的分子蛋白质，可能的降解产物中也获得阳性信号，比推定的RHAA86。该结果证明了BM86的交叉反应性质b . microplus和它的邻域哈。anatolicum．

（一种）

（b）

３．２．序列信息分析

这个Bm86的同源物的身份哈。anatolicumIzatnagar分离株(EU665682)哈。anatolicumLudhiana分离物（AF347079）分别为核苷酸序列的99.3％和98.7％，分别推导出氨基酸序列水平。BM86的身份b . microplus（澳大利亚）（M29321）分别以核苷酸序列的76.1％和60.9％分别推导出氨基酸序列水平。与HA98序列相比，在Haa86的推导氨基酸序列中观察到八个氨基酸取代。在八个中，五种氨基酸取代在自然界中是非必需的。Haa86的第20,47,290,421和438氨基酸被谷氨酸（e），甘氨酸（g），赖氨酸（k），丙氨酸（a）和天冬氨酸（a）取代，代替赖氨酸（k），精氨酸（R），天冬酰胺（N），谷氨酸（E）和甘氨酸（G）。

3.3。喂养和生殖性能哈。anatolicum

在所有的动物中，7-10天老的未布德成年人开始在释放的48小时内喂食所有动物。经过120小时的挑战，平均数为7.41.9女性蜱虫从第1组的动物掉落，而28.35.免疫组与对照组动物蜱数下降差异有统计学意义(）.一个重要的()饲养1组的蜱体重比饲养2组平均减少49.6 mg。滴下的蜱虫留作产卵，平均减少68.1毫克()，并与喂食2组动物的蜱进行比较<一个href="//www.nickgirls.com/journals/jpr/2009/tab1/" target="_blank">1）.免疫接种对女性数量的直接影响(DT%)为73.8%。其他昆虫学参数DO%、DR%和E%分别为31.3、15.8和82.3%。


实验小腿	平均值±SE
	意思是没有。蜱虫掉了下来	成年暴食平均重量(毫克)	平均蛋群（mg）

第1组（免疫）	7.4±	263.2±	149.3±
组2(控制)	28.3±5.0	312.8±9.3	217.4±19.5.

；．

3.4。犊牛的抗体反应

在第1组动物中，在第一次升压（DFI）（DFI）（DFI）的达到峰值达到达到峰值后，检测到与第2组动物相比的显着高的抗HA86抗体反应。）.攻毒时(97 dfi)，第1组犊牛抗体反应显著增加(）和抗HAA86抗体干扰了在免疫动物上喂养的蜱的喂养和繁殖效率（图<一个href="//www.nickgirls.com/journals/jpr/2009/fig4/" target="_blank">4）.直到129 dfi抗体反应维持在一个显著的高水平。

4。讨论

在我们不断努力研发疫苗的过程中哈。anatolicum，已在确定潜在疫苗的天然蛋白方面取得了进展[<一个href="#B9">9］.最近，Bm86的同源基因哈。anatolicum(Haa86)已在pBluescript II KS中克隆，用于后续在P. Pastoris.表达矢量GS115（his4) pPICZ(<一个href="#B11">11.］.表达式盒中的阅读框架的结构由N终端组成- 从Pbluescript II Ks的26bp有26 bp（)和73 bp的pPICZ序列A包括cmyc表位和6x组氨酸标签。编码序列总长度为1872 bp。线性化的pPICZHA86具有与AOX.启动子区域和AOX.的转录终止序列P. Pastoris.，帮助将表达式磁带的整合指导到AOX.1个轨迹P. Pastoris.基因组特异性同源重组导致内源性AxOx1结构基因的取代。重组HA86在甲基热带酵母中成功地表达，但在纯化中是不成功的P. Pastoris.通过镍亲和层析表达rHaa86。对rHaa86的纯化是通过利用蛋白质的粒状性质来完成的，就像纯化P. Pastoris.表达Bm86与一些修改[<一个href="#B17">17.，<一个href="#B18">18.］.

虽然该蛋白已在GS115中成功表达(his4) pPICZ一，表达水平不令人满意。可能GS115菌株不适合表达Haa86基因。其他寄生基因也出现了类似的问题，例如VSG锥虫属evansi．此外，纯化过程涉及许多步骤，中断，离心，洗涤，提取，重折叠，沉淀和超滤。在长期纯化过程中，大量蛋白质已经丢失，最终恢复显着低。在本实验中，RHAA86蛋白表达为融合蛋白，并通过亲和色谱法纯化，涉及最小步骤，从而最小化加工过程中的损失。表达水平超过40％P. Pastoris.系统。除了纯化过程中涉及的最小步骤之外，纯化方案还比先前完成的纯化水平相对较高（超过98％）[<一个href="#B11">11.］.表达的rHaa86的回收率大肠杆菌比相对较高（3.0毫克/升）P. Pastoris.表达蛋白(0.8-1.0 mg/升)[<一个href="#B11">11.］.

在免疫印迹中，抗组氨酸抗体对rHaa86的识别表明了rHaa86的全长表达。抗Bm86多克隆抗体与rHaa86的反应表明Bm86与Haa86的交叉反应性质。Saimo等人[<一个href="#B19">19.]报道了抗Bm86抗体与昆虫细胞系统中表达的Ra86 (Bm86同源物扇头蜱属appendiculatus）.这些研究表明，HA86，BM86和RA86之间的序贯表位守恒。

本实验是利用重组抗原进行的第二次免疫攻击试验哈。anatolicum，rhaa86。因此，将昆虫学参数与BM86疫苗（Gavac）的免疫试验进行比较b . microplus和哈。anatolicum第一次免疫试验的结果。对免疫后的小鼠进行免疫后的排斥反应率、繁殖指数、DT%和E%的测定哈。anatolicum是非常令人鼓舞的。Gavac疫苗针对不同菌株的E%b . microplus51%对91%。在测试b . microplusE%分别为51 ~ 60株和72 ~ 91株。这些结果是通过用b . microplus幼虫[<一个href="#B18">18.］.在本试验中，用成虫攻击免疫犊牛的效果为72.0%哈。anatolicum．本研究的E％值落在使用基于BM86的疫苗进行的不同实验的范围内。对不同菌株的Gavac疫苗的DT％b . microplus分为9％至74％。在十个菌株中，只有两种菌株显示出高于50％的菌株。在本实验中获得的73.8％的相对高的DT％是高度令人鼓舞的，并且落入商业化疫苗Gavac的范围内[<一个href="#B18">18.］.

通过比较糖基化和非糖基化的Haa86的免疫保护性能，观察到用糖基化Haa86免疫的动物饲养的蜱的DT%、DR%、DO%和E%分别为58、9、5和61.6%，用非糖基化rHaa86免疫的动物饲养蜱，其生物学指标相应降低率分别为73.8、15.8、31.3和72.0。结果表明，糖基化作用对免疫保护作用并不重要哈。anatolicum．对于Bm86抗原，糖基化可能代表约三分之一的天然蛋白，具有高度的免疫原性，但似乎对保护性免疫不重要[<一个href="#B20">20.］.重组BM86，无论是表达大肠杆菌、昆虫细胞或P. Pastoris.似乎和天然抗原一样有效[<一个href="#B21">21］.相比之下，李等人。［<一个href="#B22">22]的研究报告，碘酸处理对保护活性的破坏强烈表明，所有的保护都是由于碳水化合物表位。可以得出结论，糖基化对保护性抗原性的重要性需要根据具体情况进行评估。

昆虫学参数的显著减少高水平的蜱虫喂养组1动物相比,美联储蜱虫控制动物有直接影响的人口减少蜱虫物种在环境中,进而肯定会减少蜱虫负载的动物。