巴西的犬利尔曼西亚斯：美国内脏利什曼病的地方地区犬群的血清学随访

摘要

我们在由间接免疫荧光测定（IFA）和Western印迹（WB）估计的美国内脏Leishmaniaisis的地方区域中的血液，临床和寄生虫学随访。12个月后，从IFA获得的结果证明了50％是血清阳性，观察到两种血清学曲线：第一个范围从1/40到1/80和第二个1/160。通过WB，观察到，来自阳性犬的相同百分比和血清呈现了在IFA血清转化前8个月的29和32kDa的肽识别。在阳性狗中，来自症状寄生症的所有血清都认为68.5 kda的肽。我们的成果表明需要修改关于消除狗的控制措施。它们还证实了Western印迹的高敏感性和特异性在犬类Leishmaniaisis的诊断中，表明其与IFA相关的可能性。

1.介绍

Leishmaniaisis是由Leishmania（Kinetoplatida：Trypanosomatidaida）的几种原生子子原生动物引起的疾病，是88个国家的特有[1[根据人类活动，寄生虫群和野生和国内沙子飞行动物组成等因素，外部病变性特性有流行病学特性。在美国大陆，这个疾病，名为美国内脏利什曼病，发生在热带和亚热带地区。在巴西，除了是一个农村动物园，内脏LeishManiaisis正在成为一个围城甚至城市Zoothroponosis [2］．

国内和野生的CANID都被描述为最重要的水库婴儿利什曼虫chagasi[3.那4.］．犬利什曼病是一种慢性感染，应该被认为是鼠科皮肤的并且具有比人类疾病更严重的预后。尽管如此，就像在人类中一样，狗可以显示感染的无症状形式，或者甚至可以发展到决议[5.］．疾病的公开形式的症状是非特异性的，包括发烧，减肥，肾功能衰竭，嗜睡，onychogryhys，广义淋巴结肿大，皮肤和眼病变[6.］．

在巴西，LeishManiaisis控制措施包括基于间接免疫荧光测定（IFA）的基于间接免疫荧光测定的血清阳性犬。仅基于血清学滴度的狗的剔除1/40可能导致不良结果，因为就像在人类中一样，狗可能会控制感染L. Infantum.取决于其细胞免疫反应的能力。消除已经控制感染的血清阳性犬可能会导致另一种易感动物的替代，这是男性的新潜在的感染来源[7.］．

在旧世界中，一些研究表明，西方印迹技术是一种非常敏感和早熟的血清学工具，用于诊断内脏LeishManiaisis [8.那9.］．不同，在新世界中，有关于使用该技术的稀缺报告，并且在巴西在巴西完成了很少的研究将蛋白质印迹作为可靠的诊断测定。de paula等。[10.]证明了29和32 kDa的肽被认为是纯粹的认可利什曼虫(我)chagasi寄生犬。

在本研究中，我们重新评估了里约热内卢州内血密城区的狗的狗问题，其中已经检测到11人类的内脏Leishmaniaisis，25％的猫[11.29％的负面影响[12.]血液系，还有Lutzomyia Longipalpis.代表总砂蝇人口的19％。

本研究的目的是通过比较IFA和WB的结果并试图鉴定潜在的预后标志物来进行AVL的自然感染犬的血清学，临床和寄生虫学随访，分析感染的动力学，并试图鉴定潜在的预后标志物。

2.材料和方法

2.1。学习区

Barra de Guaratiba是大西洋和Pedra Branca山脉之间的土地，属于Rio de Janeiro State的Marra。气候是热带的，年平均温度为27.5°C，降雨量为1400毫米。人类动作改变的二次大西洋森林覆盖了山坡。

该领域中AVL控制方案实施的措施包括燃烧血液犬（IFA上的IFA）和喷涂房屋和附图，以控制成虫形式的载体。

２.２.狗的数量

在研究开始时，共有197只狗。所有的动物都是通过访问来自巴西里约热内卢里约热内卢市疫区的家进行监测的，并通过免疫荧光和western blot检测特定抗体的存在。由于控制计划的扑杀、自然死亡和主人将狗转移到其他地区，在随访过程中有大量的狗丢失。在最初的样本中，60只剩下的狗在一年中每两个月随访一次，如下:第2、4、6、8、10和12个月分别对应2月、4月、6月、8月、10月和12月。尽管有控制程序，这60只血清阳性的狗在随访期间仍留在该地区。

狗的数量是由很少或没有机会获得兽医护理的家犬组成。这项工作是根据动物实验的伦理原则进行的，并得到了Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)的动物使用伦理委员会(CEUA)的批准，巴西里约热内卢里约热内卢。

包括淋巴结触诊的临床评价以及动物的一般健康状况的升值，在血液收集时进行。

经头静脉穿刺采血。将血液样本凝块，离心分离血清(10 min/30.000)g）并储存在-20°C直到使用。

我们研究中的动物都没有接种疫苗。

2.3。如果一个

根据Camaro的前述程序进行测定[13.］．血清稀释液范围从到，作为阳性反应效价的截止点，稀释采用巴西卫生部建立。

2.4。Western Blot.

根据AISA等人进行蛋白质印迹分析。[8.］．简而言之，从蛋白酶抑制剂（菲林10mm，苯基甲磺酰芳氟戊酰0.1M，碘乙酰胺0.2M）含有可溶性相（39.191 G /30分钟)的裂解(微型炸弹细胞分裂室)l . chagasi菌株L-579 Promastigotes，在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离并呈上硝酸纤维素纸（NCP）。在4℃下用NCP的条带，将血清稀释1/50℃。通过与辣椒素过氧化物酶（Sigma，St Louis，Mo）缀合的兔抗炎IgG孵育并用H培养来检测结合的免疫球蛋白并用H开发₂O.₂（0.06％v / v）和二氨基苯甲酸（25％w / v，sigma，st louis，mo）。

2.5。寄生学随访和狗的尸检

寄生病毒随访：通过使用含有NNN培养基的可血液携带管道的可血管管，施耐德的完整培养基（Sigma，St Louis，Mo）覆盖，寄生在60只狗中的四个淋巴结被喷射，其中包括20％的胎牛血清。将管保持在27℃，并在两个月内每五天检查一次。

尸体剖检:四个60的狗被杀与过量的硫喷妥钠(十到二十五毫克/公斤,IV)和氯化钾(100毫克/公斤,IV)。在验尸,Giemsa-stained痕迹和涂片是健康的耳朵和腹部皮肤、肝脏、脾脏、淋巴结和腹水的液体和检查无鞭毛体的存在。

2.6。PCR.

对于DNA分离和PCR分析，狗的脾脏样品与胍啶-EDTA的比例混合24小时后，将混合物煮沸1分钟并保持4℃至DNA提取。也从培养中获得总DNAL.（L.）chagasiPromastigotes（MHOM / BR / 1974 / PP75）用作阳性控制。PCR根据Passos等人进行。[14.］．

2.7。点印迹分析检测Leishmania Chagasi.感染

扩增产物也通过斑点杂交分析，如Francino等人所述[15.］．

结果

３.１.如果一个

在随访初期，41.7%(25/60)的狗血清阳性，无症状，血清学滴度在到（桌子1)，尽管巴西卫生部在研究地区进行了监测。

一年后，在研究结束时，50％（30/60）的动物是血清阳性的，因此，随访期间，血清转化的发生率为8.3％（5/60）。分别在2只狗，2只狗中的6个月内观察到血清versions，和1个狗的月12日（表1）.

12个月后观察到两种血清学曲线：第一个，从1/40到1/80，由16只动物组成，整整一年内患有低血清学滴度，它们没有呈现任何症状;第二，血清学滴度1/160，由14只动物组成，具有呈现更高的血清学滴度和一些显示症状和组织寄生寄生的狗的倾向。

３．２．犬的临床和感染情况

一年后，14只狗的五个属于概况2显示出现在8到12个月之间的症状，所有这些都有IFA滴度1/320。在所有五只狗都被观察到冷漠和减肥。在2只动物中观察到肝脾肿大，2只动物的离散淋巴结病，1只动物的onychogryhoss病，1只动物中的qualcoholyhoss（表2）.其中一只狗死了，其他的狗都被安乐死并进行了尸检。

3.3。Western印迹分析

在随访期间通过Western印迹获得的结果，抗原识别的轮廓没有显示出任何差异，除了血清频道的血管增加的犬和其识别强度的血迹。

它观察到具有强烈的抗原识别模式的高筛选性（50％）。公认的多肽级分在4-220kDa的范围内，并且所有具有确认感染的动物的所有动物都识别为29和32 kDa的肽带（图1）.只有5个症状狗的血清就是除了29和32的乐队之外的乐队68.5（图1和2)，所有动物均呈血清学效价1/320。

来自疫区和非疫区未感染犬的血清显示出相同的识别模式，包括对37、42.5和71.5 kDa抗原的弱识别。30份阴性血清只能微弱地识别最多5个肽段，不包括肽29、32或68.5 kDa。

3.4。寄生学评估

在尸检的所有四种动物中，在肝脏，脾脏，皮肤和淋巴结印记中发现了amastigotes（表2）.

在这些动物中，它被观察到腹水和从这只狗，几升腹水液体被强烈的寄生虫刺穿。4只尸体标本的血清学滴度分别为1只1/320和3只1/1280。2只血清学为1/1280的狗被严重寄生。

从30只血清阳性犬中的四只血液阳性犬中的扩大爆发性淋巴结的刺穿是孤立的所有含量利什曼虫。

3.5。PCR和DOT印迹分析检测利什曼虫chagasi(利什曼虫)感染

研究的所有样品都是重复实现的。在两只狗样品的琼脂糖凝胶中的扩增产物的可视化中，两者都是阳性，扩增120 pb的产物，对应于保守的KDNA区域利什曼虫sp。

将扩增的产物与特定的探针杂交后L. Infantum.，阳性样本确认为利什曼虫(我)chagasi所有阴性样本都保持负面（图3.）.

4。讨论

在犬内脏利什曼病中，低水平的抗体产生与低寄生虫血症相关，相反，高抗体产生与临床疾病相关，是寄生虫检测的最佳机会[7.那16.那17.］．

在目前的研究中，我们通过IFA对犬群进行了一年的随访，观察到了两种血清学特征的发生。一种类型的动物全年血清滴度较低，可能处于感染的早期阶段，或通过类似的机制控制感染莱山岛Infantum [7.那18.］．另一方面，型材的所有动物都显示出血清学滴度的增加，其中一些达到1/1280，表明这些动物可能会失去控制感染的能力，在几周内呈现症状和大量寄生虫。

已经提出了一种有效的控制措施，剔除感染犬与滴度1/40 [19.那20.];然而，一些研究反对使用这种方法[21.那22.］．我们的结果表明，如果采取控制措施，包括撤退血清阳性狗，必须保持临界值(1/40)作为阳性的标准。然而，只有滴度为属于轮廓二的1/160应该被消除。可能是那些血清学滴度高和组织寄生的动物对沙蝇更有传染性，因为狗的传染性和沙蝇感染的比例已经被认为与抗沙蝇强相关莱山岛皮肤病的抗体水平和强度[4.那20.那23.］．

对于属于1型的动物，仍应进行监测，因为这些狗可能反映了不同的临床流行病学情况，如感染的早期阶段或宿主的自然抗性。

在一项对暴露于地中海利什曼病三个传播季节(2002年至2004年)的43只比格犬进行的纵向研究中，作者观察到的结果至少在一定程度上与我们的数据相印证，因为他们确定为感染，动物具有血清学滴度组织寄生是否有症状另一方面，狗被认为是亚专利感染，当他们提出滴度无组织可察觉的寄生[24.］．

此外，不显示疾病迹象的剔除动物通常会导致掩饰动物的所有者，防止它们甚至被检查和测试，从而导致寄生犬的持久性。

Western Blot测定被认为是诊断犬美国内脏Leishmaniaisis的高度特异性和早熟的方法，因为29和32kDa的寄生肽级分与发生的寄生肽莱山岛狗感染[10.］．我们的结果与这些观察结果一致，因为所有感染犬的血清在IFA血清转化前8个月就能识别29和32 kDa的肽段，尽管这并不意味着疾病结局的预后。

识别68.5 kDa波段可能具有预后价值;事实上，只有5只有症状的狗的血清与此部分反应，而25只无症状的狗的血清没有显示识别(图)2）.同样的结果也在12只有症状的狗的血清中被观察到，这些狗来自不包括在本研究的其他地区的42只动物(数据未显示)。

根据Carrera等人。[25.]在实验感染的狗中L. Infantum.，具有较差的临床演进的动物血清对一些抗原的识别与活性的神经球菌倍增有关。我们认为只有症状犬血清识别68.5 kda肽可能代表类似的机制。

在症状方面，在我们的研究中，没有观察到任何可以描述为利什曼病特征的迹象，因为阴性犬也表现出与阳性犬相同的症状，不同的是阴性犬的症状有逆转的趋势。在阳性和阴性犬中，体重减轻是最常见的症状。所有动物均未见皮肤损伤，值得指出的是，所有症状动物均表现为耳、腹部皮肤无鞭毛。这些观察表明，即使没有皮肤损伤的狗，也可能是沙蝇的一个重要感染源。

其他作者也观察到淋巴结培养[26.那27.[表明不是一种有用的诊断方法，即使在耳朵皮肤，肝脏和脾脏印记中，也无法将寄生虫与狗的寄生虫分离出来，可能是因为培养污染在不充分的现场条件下发生。

致谢

这项工作收到了CNPQ / FIOCRUZ-PAPES IV，FAPERJ-APQ1以及Instituto Oswaldo Cruz的财务支持。作者也很感谢MarcosAntônioDosSantosLima和WagnerLançaCassos的技术支持。

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