尿道支原体脂蛋白通过激活核因子诱导人单核细胞表达促炎细胞因子和凋亡B.

抽象的

本研究旨在观察负责促炎细胞因子的基因表达的诱导的分子机制和细胞凋亡在人单核细胞系THP-1刺激的脂蛋白（LPS）从制备尿道支原体．对培养的细胞进行刺激．基因遗利产物LP分别分析用ELISA和RT-PCR产生促炎细胞因子和它们的mRNA表达的。细胞凋亡也通过膜联蛋白V-FITC-碘化丙啶（PI）染色和吖啶橙（AO）-ethidium溴（EB）染色检测。核因子的DNA结合活性B（NF-b）通过电泳迁移率移位测定（EMSA）评估。结果表明，LP刺激了THP-1细胞产生肿瘤坏死因子 -(肿瘤坏死因子-), interleukin-1（IL-1)和IL-6呈剂量依赖性。mRNA水平也在LP刺激下上调。LPs还可以增加NF-的dna结合活性B，一种诱导细胞因子mRNA表达和细胞凋亡的可能机制。这些效果由PDTC消除，NF-抑制剂B.我们的结果表明．基因遗利产物由于LP产生促炎细胞因子和诱导细胞凋亡的能力可能是某些疾病的重要病因因素可能是某些疾病的重要病因因素，这可能是通过NF的激活介导的B.

1.介绍

尿道支原体是一种细胞壁的细菌病原体，其区别于具有任何自我复制细胞的最小已知的基因组，它是在1981年发现的，当从两名男性的尿道炎尿道炎中分离出来[1］．感染的确切方式以及由M. Genitalium.仍有待解决，但病原体推定为性传播，感染往往表现为慢性和无症状[2那3.］．大多数调查涉及男性尿道炎患者，但M. Genitalium.也涉及盆腔炎，肺炎，节肢症和艾滋病[4.-6.］．

众所周知M. Genitalium.由终端尖端的细胞器，其对于致病性的第一步粘附于宿主细胞。但是，确切的分子发病机制M. Genitalium.模糊[7.］．有人建议，支原体感染期间，到宿主细胞的损坏不在直达病灶，但通过免疫机制引起的[8.-10.］．脂蛋白（LPS）是在表面上暴露的重要蛋白质M. Genitalium.．LP通过与宿主细胞的密切相互作用，可影响单核细胞、巨噬细胞和脑星形胶质细胞的功能，进而导致促炎细胞因子的产生，特别是坏死或凋亡[11.］．例如，m . fermentans蛋白激酶K-消化的LP的脂质提取物可以诱导巨噬细胞释放促炎细胞因子，例如肿瘤坏死因子 -(肿瘤坏死因子-), interleukin-1（IL-1)和IL-6通过激活核因子-κB（NF-κB)和激活蛋白1 [12.］．

近年来研究发现，支原体脂蛋白和脂肽能够通过toll样受体2 (toll-like receptor 2, TLR2)和TLR6导致巨噬细胞凋亡[13.那14.］．TLR2的信号转导导致核转录因子NF-的激活κB和NF-的诱导κB-Screadge基因如Bcl-Xs，Bax，并且在激活后坏[15.］．NF -κB活化可能对细胞凋亡的影响有两倍，抑制细胞凋亡或加速细胞死亡，这取决于不同的细胞系和不同的刺激。

目前尚无关于致病性的研究报道M. Genitalium.然而，对人核细胞;我们已经研究过M. Genitalium.LP可诱导人单核细胞THP-1表达促炎细胞因子并诱导细胞凋亡。因此，本研究旨在研究是否M. Genitalium.LP诱导的单核细胞细胞凋亡与NF的激活有关κ并评价特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)对促炎细胞因子产生和凋亡的影响。

2.材料和方法

2.1。细胞培养和刺激

将人单核细胞THP-1(武汉大学中国类型培养收集中心，中国武汉，中国)培养在含2 mmol/L L-谷氨酰胺和10%热灭活胎牛血清(美国Hyclone，美国)的RPMI 1640培养基中^°C有5％的CO₂．在24微米板（纽约州）的24微孔板（Costor，NY，USA）中，在1％FBS中培养细胞的浓度为10^5.刺激前的细胞/ mL。0.5到5 g / ml lp或0.1 将G / ml脂多糖（LPS，Sigma-Aldrich，Mo，USA）加入到培养基中24小时。为了评估PDTC的效果，用25次预孵育细胞 M PDTC（Sigma-Aldrich）在刺激前30分钟。

2.2。支原体培养和LP制剂

M. Genitalium.（G-37菌株，ATCC）在改性的SP-4培养基中培养，直至固定相开始，然后通过离心造粒。LP的制备和水相（用作对照）遵循先前描述的方法[16.］．通过甲醇沉淀Triton X-114相中的脂蛋白，并在悬浮在无菌PBS中刺激。通过使用双子胆酸试剂盒（Pierce，Oud Beijerlands，荷兰）测定蛋白质浓度。制剂预先孵育100 g/mL多粘菌素B刺激前2小时，以消除制备过程中内毒素污染的可能性。

2.3。用于细胞因子检测的测定

如上所述，在24孔组织培养板中培养并刺激THP-1细胞。在24小时后刺激，通过两个连续的冷冻/解冻循环裂解细胞，因此样品代表所产生的细胞因子的总量（细胞内和释放到上清液中的那些）。通过使用人TNF来测量细胞因子浓度，IL-1， IL-6 ELISA试剂盒(晶美生物技术，中国深圳)。上清采用定量“夹心”ELISA技术，使用检测的细胞因子特异性单克隆抗体检测细胞因子。ELISA试剂盒检测TNF-的检测限，IL-1、IL-6分别为7 pg/mL、2 pg/mL、2 pg/mL。这些测定是按照制造商的说明书进行的。

２.４.RT-PCR检测细胞因子表达

用Trizol试剂（Invitrogen Life Technologies，Calif，USA）从处理过的THP-1细胞中提取总RNA。通过使用AMV逆转录酶XL（Takara，Dian，China）进行来自总RNA的第一链cDNA合成。PCR产物的引物序列和尺寸如下：-Actin（564 BP）：-CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA-(正向引物)和-aag gaa ggc tgg aag agt gc-3（反向底漆）;IL-1（25.2 bp):- tat tac agt GGC aat gag g -(正向引物)和-AG AAG GGA AAG AAG GTG-（反向底漆）;TNF-(324年英国石油公司):-cag agg gaa gag ttc ccc ag-(正向引物)和-cct tgg tct ggt agg aga cg-（反向底漆）;和IL-6（430 BP）：- tga CCC aac ac aaa tgc -(正向引物)和- cga GCT CTG aaa caa agg at -(反向引物)。对最终体积为100的混合物进行PCR含有20升 l细胞因子或-Actin cDNA在下列条件下使用DNA热循环仪（Eppendorf，汉堡，德国）：35周期为94次^°C，在66 45第二退火^°c对于tnf-，63^°C对于IL-6，或58^°下IL-1和-肌动蛋白，72度延长1分钟^°C. PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色可见。

2.5。核蛋白质制剂和电泳迁移率凝胶转移测定（EMSA）

将THP-1细胞在1％FBS中培养24小时，然后用LP刺激（3 g / ml）以指示的时间间隔。在Muller和Homaidan报告的议定书中分离核提取物之前，在冰上收集细胞[17.那18.］．简而言之，细胞（10^6./ ml）用冰冷的PBS洗涤，悬浮在200 L裂解缓冲液（10mM HEPES [pH7.9]，10mM KCl，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT），并在冰上溶胀15分钟，然后12.5 添加了10％的Nonidet p-40。然后将管用涡旋混合器彻底混合10秒钟，以便在4时离心（20,000g）^°c持续8分钟。由此获得的核颗粒重新悬浮于25 L冰冷的核提取缓冲液（20mM HEPES [pH7.9]，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT），并在冰上保持15分钟，间歇性搅拌。将样品在4℃下进行离心5分钟^°C，上清存于^°C用Bio-Rad蛋白检测试剂盒(Bio-Rad, Munich, Germany)测定其蛋白含量。

检测激活的NF-κB根据制造说明，通过使用生物素标记的EMSA试剂盒（天通，宁波）完成未刺激和刺激细胞的核。共识NF-κ试剂盒中包含的B寡核苷酸为-agt tga ggg gac ttt ccc agg c-．

2.6。细胞凋亡的测量

下面使用了两种不同的技术。(1) AO-EB染色，一种能够区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞的排除染色方法[19.］．在诱导细胞凋亡诱导后12小时，收集细胞，以500g离心10分钟，重新悬浮于100 L PBS。25个样品来自每种培养的L与AO-EB染色（最终浓度1 g/mL)，荧光显微镜下观察。每个样本中随机计数至少200个细胞(重复)，计算凋亡细胞百分比;(2) Annexin-V-FITC-PI染色，检测早期凋亡时质膜外叶磷脂酰丝氨酸(PS)的暴露，可区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞(不区分晚期凋亡细胞和坏死细胞)[20.］．一个T.12. hours after induction of apoptosis, cells were washed with PBS, centrifuged and resuspended in 400 l含有粘合剂（10 mm Hepes / NaOH，140 mm NaCl，2.5 mm Cacl₂PH7.4)。Annexin-V-FITC (5l;10. 将g / ml）加入195的样品中 L细胞悬浮液混合，在室温下在黑暗中孵育10分钟，用PBS洗涤，并重新悬浮于190 的缓冲液含有10结合大号 L (1g / ml）。The double-stained cells were analyzed by the FACS within 10 minutes (10^4.细胞/样品）。

在所有凋亡的测量中，通过从总凋亡(受刺激的细胞)中减去自发凋亡(未受刺激的细胞)的百分比来确定凋亡的细胞百分比。

2.7。统计分析

从三个独立实验获得的数据表示为平均值±SE。通过单向ANOVA测试分析数据，然后是独立样本进行分析T.使用SPSS软件进行测试。一个P.-Value小于0.05被认为是显着的。

3.结果

3．1.生殖支原体LP标记THP-1细胞因子的产生

LP准备好了M. Genitalium.刺激THP-1细胞产生TNF-，IL-1和IL-6呈剂量依赖性(图1)。剂量响应棒显示3 G / mL诱导TNF的LP的最佳浓度[pg / mL), il - 1[ pg/mL], and IL-6 [ pg/mL], leading to cytokine concentration similar to those obtained with 0.1 克/ mL的LPS [TNF-pg / mL,IL-1pg / mL,IL-6pg / mL,］．有趣的是，当LP的浓度从3增加时 g / ml到5 g/mL时，细胞因子水平降低。LPS对LP的污染与此无关，因为经多粘菌素B预处理的LP对TNF-没有影响生产（图2)。

３．２．诱导肿瘤坏死因子-，IL-1和LP处理后的IL-6 mRNA表达

由于细胞因子mRNA主要在转录水平调控，我们检测了TNF-的表达水平，IL-1， IL-6 mRNA的RT-PCR检测。如图所示3.，添加3 g/mL LP刺激18小时后，上述3个基因的mRNA表达增加作为内部对照的-Actin在所有样品中类似。

3.3。PDTC诱导的TNF下调，IL-1，和IL-6生产及其mRNA表达

我们发现NF-κB抑制剂PDTC显着抑制了TNF的生产，IL-1和THP-1细胞中IL-6的表达M. Genitalium.LP。如图所示1， TNF-水平，IL-1和IL-6在条件培养液中的表达g/mL LP与25M PDTC显着低于治疗3的细胞培养基 g/mL LP．PDTC对TNF-表达的影响，IL-1经RT-PCR检测，lp刺激的细胞中IL-6 mRNA表达相似(图)3.)。

3．4．生殖支原体LP诱导NF-κB由EMSA激活

在这项研究中，我们调查了吗？M. Genitalium.LP能够触发NF-κB激活。为此，用LP在不同时间间隔(NF-)刺激THP-1细胞κ如部分所述，通过非酰化物质EMSA评估核提取物中的DNA结合活性2．如图所示4.那M. Genitalium.LP能激活NF-κB在THP-1细胞中：DNA结合活性在2小时的刺激下最大化，然后下降。nf-的特异性κ通过竞争分析验证B DNA结合，具有过量的未标记特异性或未特异性的寡核苷酸。

3.5。M. Genitalium LP诱导细胞凋亡通过annexin-V-Fitc-pi和Ao-EB染色

通过以下两种技术检查凋亡细胞的百分比。（1）附睾-V-FITC-PI染色的典型实验显示在图中5.．通过这种技术，坏死和晚期凋亡细胞不能被彼此区分开，因此，我们的结论是，双阳性细胞（膜联蛋白V-FITC和PI）表示的晚期凋亡细胞和坏死不那些。在三个独立的实验获得的结果显示约诱导凋亡细胞百分比的百分比减少M. Genitalium.LP与LPS控制相比和lp与25组合 中号PDTC诱导的细胞．(2) AO-EB染色通过细胞核形态变化(坏死细胞缺乏DNA凝聚推测为凋亡细胞)来区分凋亡细胞M. Genitalium.LP诱导细胞凋亡或坏死。细胞凋亡在感染的THP-1细胞中减少了约61％M. Genitalium.LP与25组合 m pdtc.， 和。。比较M. Genitalium.LP感染细胞和LPS处理的细胞（表1)。

4.讨论

虽然支原体致病性的分子基础仍然尚不清楚，但对LP诱导的免疫系统的调节作用似乎在支原体相关疾病的发展中发挥着重要作用[21.］．支原体的最佳记录效果之一是单核细胞诱导无数细胞因子[9.］．例如，m . fermentans衍生LP已被证明诱导炎症介质例如TNF，IL-1，以及小鼠巨噬细胞释放的IL-6 [4.那22.］．在本研究中，我们已经证明脂蛋白衍生自人体M. Genitalium.能够诱导THP-1细胞产生促炎细胞因子并通过激活NF-κB.

试图澄清潜在的致病性M. Genitalium.，我们已经在这项研究中证明了LP来自M. Genitalium.可以触发THP-1细胞产生TNF-，IL-1和IL-6以剂量依赖的方式。但是，当LP的浓度从3到5增加时 g/mL时，炎性细胞因子水平降低。这可能是因为假设过高浓度的LP可能对THP-1细胞有毒，从而减少炎症细胞因子的产生[8.］．我们还发现，PDTC，NF-抑制剂κB (23.[可以显着抑制用LP处理的THP-1细胞产生炎性细胞因子，并抑制它们的mRNA的表达。TNF-IL-6和IL-1是重要的炎症介质:它们可以刺激快速的中性粒细胞内流，这些细胞是宿主防御的有效介质，直到诱导抗原特异性机制消除病原体。然而，刺激细胞因子的产生也不可避免地影响炎症反应的发生，这可能直接或间接地促成疾病的发病和组织损伤[24.］．

最近的研究表明存在NF-κB绑定站点细胞因子基因的转录调控区域。NF -κB被认为是一种广泛的快速反应转录因子，通常在各种细胞的细胞质中表达[25.那26.］．由于诱导的基因特异性识别元件位于上游启动子区域，我们研究了TNF-是否产生，IL-1、IL-6及其mRNA在THP-1细胞中的表达M. Genitalium.LP与NF-的活化有关κB.通过使用电泳迁移率偏移和反式激活测定，我们已经清楚地证明了LP可以诱导NF-的转录激活κB;T.he activation peaked 2 hours after stimulation. The above results indicate that LP fromM. Genitalium.是nf-的有效活化剂κB和NF -κB的活化可能对诱导TNF-的产生非常重要，IL-1，和IL-6和它们的mRNA的表达。

细胞凋亡是细胞死亡的一种主要形式，最初表现为一系列典型的形态学改变。这些变化反映了被称为caspases的半胱氨酸蛋白酶家族所进行的复杂的生化反应[27.-29.];但仍有一个问题有待回答M. Genitalium.LP在诱导炎症因子产生的同时，还能通过巨噬细胞诱导细胞凋亡。在本研究中，THP-1细胞中检测到细胞凋亡M. Genitalium.通过Annexin V-FITC-PI和AO-EB染色，发现PDTC抑制细胞凋亡活性M. Genitalium.LP诱导的THP-1细胞死亡与NF的激活部分相关κB (4.］．在传染病方面，细胞凋亡似乎是针对掩藏细胞中的微生物的防御机制之一，这不一定具有对它们具有任何机制的细胞。然而，过量的免疫细胞凋亡可能会影响原发性感染部位中的免疫应答，从而使支原体容易扩散[30.那31.］．凋亡相关的细胞因子很可能是TNF-巨噬细胞和淋巴细胞对支原体脂蛋白产生的反应，在细胞毒性的表达中起重要作用。这一推测得到了研究结果的支持m . fermentans增强刀豆蛋白a诱导的小鼠脾t细胞凋亡及TNF-在活动中起着关键的作用[32.］．不过，无论这些细胞因子发挥对细胞毒性有一定影响M. Genitalium.LP对THP-1细胞的作用尚不清楚。对其分子机制的进一步研究正在进行中。

上述结果表明从LPM. Genitalium.是nf-的有效活化剂κB，而NF-κB启动可能是非常重要的诱导产生促炎细胞因子及其mRNA和从LP细胞凋亡刺激M. Genitalium.．由于致炎细胞因子在感染性疾病后遗症的发病中起重要作用，抗细胞因子治疗的炎症反应的成功可缓解由支原体感染引起的异常免疫反应。现在很清楚的是NF-κBκB参与了这种调节，这些发现有助于解开对支原体感染免疫反应的复杂机制，并可能最终被证明有助于开发新的治疗策略，以防止支原体相关疾病中的组织损伤[33.］．

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no. 5130442);30570093)。作者在此感谢袁春阳和郑江华的帮助。

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