COX-2基因启动子多态性与中年男性冠状动脉疾病:赫尔辛基猝死研究

摘要

环加氧基酶（COX）催化前列腺素的形成有助于动脉粥样硬化中的炎症。我们的目标是研究功能性C变种吗？人COX-2基因多态性与冠状动脉水平的冠状动脉粥样硬化严重程度相关。赫尔辛基突然死亡研究的尸检材料(n= 300)由突然死亡的芬兰男性组成。定量冠状动脉粥样硬化病变面积，测量冠状动脉狭窄。评估心肌梗死(MI)的发生情况。基因分型采用限制性内切酶分析。携带次要C等位基因的男性有更大区域的复杂病变(P.= .024）和较多的冠状动脉有超过50％的狭窄（P.= .036)与具有共同GG基因型的男性相比。COX-2多态性与心肌梗死无关。我们的数据表明COX-2可能参与了斑块的生长。

1.介绍

环氧化酶(COX)催化前列腺素生产的前两个步骤，从花生四烯酸到许多前列腺素，包括前列环素和血栓烷。这种酶有三种已知的异构体。在基础条件下，COX-1在大多数人体组织中组成表达。COX-2表达主要是由生长因子、有丝分裂原和细胞因子对炎症刺激的反应诱导的[1］．COX-3是COX-1衍生的同工酶。它的功能作用仍然仍然很差[2］．

COX-2水平在动脉粥样硬化等慢性炎症性疾病中升高。在人动脉粥样硬化病变的内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞和巨噬细胞中检测到COX-2表达[3.那4.］．COX-2途径产生的许多前列腺素，包括血栓素，刺激血管收缩，血小板聚集，白细胞-内皮细胞粘附，这些都有助于动脉粥样硬化和血栓形成[5.-7.］．而内皮细胞产生的前列腺素主要是前列环素(prostacyclin, PGI)₂)，作为血管扩张剂，抑制血小板聚集、白细胞活化和粘附[8.］．

功能性G.C多态性位于转录起始位点上游的765个碱基对(−765G)c）已在人Cox-2基因中鉴定在具有C等位基因的基因中，导致体外启动子活性减少[9.］．先前的研究表明，C等位基因可能对临床事件具有保护作用，例如心肌梗死(MI)、中风[10.]脑血管缺血[11.］．C等位基因也可能与心/脑血管和高胆固醇患者中较低水平的炎症标志物(如C反应蛋白和白细胞介素-6)有关[9.-12.］．然而，与这些先前的数据相反，Hegener等人没有发现COX-2多态性/单倍型与心肌梗死或缺血性中风风险之间存在关联的证据[13.］．此外，Kohsaka等人最近报道COX-2-765GC多态性实际上是非洲裔美国人中风的一个风险因素[14.］．

先前相互矛盾的观察结果表明，需要进一步评估COX-2 765G之间的相关性C多态性和心血管疾病。我们已经研究了这种多态性与冠状动脉水平的动脉粥样硬化的严重程度的关联，以前收集了突然从医院突然死亡的芬兰人的遗传均匀群体的尸检系列。

2.对象和方法

2.1。主题

HSDS旨在调查生活在赫尔辛基的芬兰中年男性突发死亡的诱因及其环境[15.］．尸检系列是1991-1992年12个月期间在赫尔辛基大学法医学系收集的。尸检的适应症包括先前健康的人在医院外死亡、意外死亡、怀疑中毒、自杀和与医疗有关的死亡。原始研究人群包括300名33-70岁男性(平均53岁)的前瞻性系列研究。这一系列尸检涵盖了在该研究期间赫尔辛基地区这一年龄组所有死亡男性的28%。死亡原因为心脏疾病(冠心病、心肌病、心脏肥厚或扩张)(38.3%)(n= 115)，其他疾病占20.3% ()和暴力死亡(自杀和事故)的比例为41.4% ()．具有冠状动脉事件（MI，AMI的男性，冠状动脉血栓或仅冠状动脉血栓）（n还与没有冠状动脉事件的男性相比，也与男性相比（n= 228）。

2.2。冠状动脉疾病的测量

在尸检时，使用与氧化铅混合的硫化液硅橡胶作为造影剂进行冠状动脉造影术[16.］．在橡胶模型上用千分尺测量左前降支(LAD)、右冠状动脉(RCA)和左旋动脉(LCX)主干近端、中端和远端狭窄。冠状动脉狭窄的百分比是将最大狭窄的直径(毫米)除以同一根动脉模型中最近的未受影响部分的直径。基于1、2或3条主要冠状动脉存在超过50%的狭窄，研究人群根据病变血管的数量分为亚组。

游离、切开LAD、LCX和RCA近端，连接到卡上，然后固定在10%缓冲福尔马林中。随后用苏丹IV法对血管壁进行脂肪染色。评估下列动脉粥样硬化变化:脂肪条纹、纤维斑块、复杂病变和钙化区域。平坦或隆起的内膜病变被苏丹IV染色清楚，没有显示更复杂的变化被分类为脂肪条纹。不显示溃疡、出血、坏死或血栓形成的升高病变被认为是纤维斑块。如果一个区域表现出上述的一种或几种变化，并伴有或不伴有钙沉积，则视为复杂病变。在x光片上显示强烈阳性信号的部分主动脉被认为是钙化区域。使用标准平面测量技术评估动脉粥样硬化病变面积和冠状动脉节段总面积[15.］．基于冠状动脉的总表面积来计算发散的椎间球菌的比例[15.］．通过心肌的宏观和组织学检查证实了该系列中MI的发生。当纵向解剖冠状动脉时，在尸检时记录冠状动脉血栓存在。

在300例病例中，尸检和COX-2基因型数据是可用的，这些包括最终研究人群。

２.３.冠心病的危险因素

死者的配偶、亲属或亲密朋友在尸检后两周内接受采访。除了与猝死风险(即动脉高血压、糖尿病)有关的问题外，还列入了界定死者吸烟习惯的其他问题。他的亲戚/朋友被问及这个人一生中是否吸烟，以及他每天抽多少支烟。收集148例患者吸烟习惯资料。118例患者除了COX-2基因型和尸检数据外，还获得了所有危险因素的完整数据。

2.4。COX-2基因分型

围绕-765g的部位的人Cox-2基因的启动子区域以心肌dna为模板，聚合酶链反应(PCR)扩增C多态性。根据已公布的人COX-2基因(NCBI/U04636, gi: 496975)序列，利用Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)．25μ.l反应由每个引物(TAG Copenhagen, Copenhagen, Denmark) 50 pmol组成(正向-CATTAACTATTTACAGGGTAACTGCTT -；反向-tgcagcacatacatacatacatagcttttt-), 200μ.M的每个dNTP和2,5 U HotStarTaq DNA聚合酶在1 PCR buffer (Qiagen, Valencia, CA, USA). PCR conditions included 15 minutes of initial polymerase activation step at 94^°在94℃时进行35次三步变性循环^°C持续30秒，在56时退火^°C转30秒，72分机^°C为30秒，最终延长72^°C 5分钟。

引物扩增出228 bp的片段，经sii (Fermentas, Vilnius, Lithuania)限制性内切酶进行基因分型。PCR产物在G等位基因存在的情况下，可分为168 bp和60 bp的片段。酶切产物用2% MetaPhor (Cambrex, East Rutherford, NJ, USA)琼脂糖凝胶电泳分解，溴化乙啶染色显示。

2．5．统计分析

结果采用SPSS for Windows软件14.0版本(SPSS, Chicago, IL, USA)进行分析。对于连续变量，报告均值±标准误差(SE)。对于正态分布的连续变量，以年龄、体重指数(BMI)、吸烟状况(yes/no)、高血压(yes/no)、糖尿病(yes/no)为协变量，采用单因素方差分析。由于测量动脉粥样硬化变化的变量不是正态分布的，因此对脂肪条纹、纤维斑块、钙化和复杂病变的值进行了对数转换，但结果以粗略的形式显示。

3.结果

在研究人群中，COX-2基因型频率为GG 74.4％，GC 24.3％和CC 1.3％。由于只有4例代表CC基因型，携带C等位基因的男性将汇集在一起​​作为一个组进行统计分析。

与GG基因型相比，携带C等位基因的男性冠状动脉的复杂病变面积明显更大(P.= 0.024)，并根据年龄和BMI进行调整。在进一步调整吸烟、高血压和糖尿病后，基因型和钙化之间有显著差异(P.= .031）和基因型和复杂的病变（P.= .017)(表1， 数字1)．COX-2基因型与纤维斑块或脂肪纹面积无显著差异。C等位基因携带者在1、2或3条主要冠状动脉有超过50%的狭窄(P.= .036）与GG基因型的那些，调整年龄和BMI。经过进一步调整吸烟，高血压和糖尿病后，这种差异更为显着（P.= .008）（表1， 数字1)．通过年龄，BMI，吸烟，高血压和糖尿病作为协变量，基因型与MI（急性，旧，或任何MI）的基因型和发生的发生之间没有统计学意义（表1)．

具有冠状动脉事件（MI，AMI的男性，冠状动脉血栓或仅冠状动脉血栓）（n还与没有冠状动脉事件的男性相比，也与男性相比（n= 228）。在冠状动脉事件组中，携带C等位基因的男性在冠状动脉中的复杂病变显着大，而不是GG基因型调整年龄和BMI（P.= .040)，在进一步调整吸烟、高血压和糖尿病(P.= .015)。同样，在冠状动脉事件组中，与GG基因型的患者相比，C等位基因携带者在1、2或3条主要冠状动脉中有超过50%的狭窄，校正了年龄和BMI (P.= .040)，在进一步调整吸烟、高血压和糖尿病(P.= .050）（表1)．在冠状动脉事件组中，COX-2基因型与纤维斑块或脂肪条纹面积之间没有显著差异(数据未显示)。无冠状动脉事件组的基因型没有差异(见表)1)．

4。讨论

本研究的结果提出了中年芬兰男性突然死亡，携带COX-2 765G的稀有C等位基因C多态性具有更常见的冠状动脉斑，其特征在于与GG基因型的男性相比具有更广泛的复杂性病变。这种关联在具有冠状动脉事件的主题中最为明显。Cox-2启动子基因型的变异显示出与脂肪条纹和纤维斑块的早期冠状动脉粥样硬化的关系。之前的一项研究表明，765克c等位基因可能对心肌梗塞提供保护作用[10.］．C等位基因也可能与心/脑血管和高胆固醇患者中较低水平的炎症标志物(如C反应蛋白和白细胞介素-6)有关[9.那12.］．与这些先前的数据相比，Hegener等人没有发现多态性与心肌梗死发生风险相关的证据[13.］．此外，Kohsaka等人最近报道了765GC等位基因实际上是非洲裔美国人中风的一个风险因素[14.］．我们没有在MI上观察到这种多态性的关联，但是需要比我们的材料更大的样本量来解决这个问题。然而，我们对冠状动脉水平复杂动脉粥样硬化的观察提示765GC等位基因实际上是冠状动脉疾病的危险因素。我们研究的一个主要限制是，只有118个受试者，冠状动脉疾病的危险因素完整数据。然而，这种进一步的统计调整加强而不是在原来的300名男性上减弱我们的调查，调整为年龄和BMI。然而，对更大样本的研究是确认目前调查结果的必要条件。

与GG纯合子相比，携带C等位基因的男性有更多的冠状动脉狭窄超过50%。相比之下，C等位基因与动脉粥样硬化严重程度之间的关系此前已在意大利人群的冠状动脉水平通过血管造影进行了研究，但没有发现关联[10.］．研究中的多态性在芬兰语群体中似乎相对罕见，频率为74.4％，GC 24.3％和CC 1.3％，而在意大利人口频率下，GG 50.7％，GC 43.3％和CC 6.4％[10.］．

狭窄在具有C等位基因的男性中比在具有GG基因的男性中更常见，这一发现可能支持C等位基因可能导致更广泛的斑块生长的假设。事实上，由于C等位基因导致启动子活性降低[9.，它可能有助于降低前列腺素的产生。基质金属蛋白酶(MMPs)和细胞外基质(ECM)降解酶被PGE部分上调₂通过COX-2路线产生。由于PGE减少了₂生物合成，MMP-9表达的减少可以遵循[17.]并通过平滑肌细胞导致细胞外基质的积累。符合我们的结果，CIPLONE等。[10.]报道，与GG纯合子斑块相比，C等位基因携带者颈动脉斑块中有更多的间质胶原，可促进斑块生长[18.那19.］．

总之，稀有COX-2基因C等位基因与复杂的斑块相关，冠状动脉水平的严重狭窄。这表明COX-2可以参与斑块生长。没有看到对MI的保护作用。

致谢

本研究得到了芬兰文化基金会Pirkanmaa区域基金的坦佩雷大学医院医学研究基金的资金，芬兰心血管研究的芬兰基础，以及YrjöJahnsson基金会。

参考

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