(-)表没食子儿茶素没食子酸酯降低成骨细胞血小板衍生生长因子bb刺激的白细胞介素-6合成:抑制SAPK/JNK

抽象的

我们以前表明，丝裂原激活蛋白（MAP）激酶超家族，P44 / P42 MAP激酶，P38 MAP激酶和应激活化蛋白激酶（SAPK）/ C-Jun- 在血小板衍生的生长因子-BB-（PDGF-BB-）中，呈蛋白衍生的生长因子-1（PDGF-BB-），刺激的合成白细胞介素-6（IL-6），一种效率的骨复膜剂，在成骨细胞样MC3T3-E1细胞同时AKT和P70 S6激酶对合成产生负面调节。在本研究中，我们研究了（ - ） - EPIGALLOCATECHIN gallate（EGCG），主要的绿茶类黄酮类化合物中的一种，影响了这些细胞中IL-6的合成和该机制。EGCG显着降低了通过PDGF-BB刺激的IL-6合成和IL-6 mRNA表达，EGCG在初级培养的成骨细胞中也减少了PDGF-BB刺激的IL-6合成。EGCG对MC3T3-E1细胞中骨钙素和骨盆素水平没有影响。PDGF受体的PDGF-BB诱导的自磷酸化EGCG没有抑制。P44 / P42映射激酶和P38映射激酶的PDGF-BB诱导的磷酸化不受EGCG的影响。另一方面，EGCG明显抑制了PDGF-BB诱导的SAPK / JNK的磷酸化。最后，PDGF-BB诱导的AKT和P70 S6激酶的磷酸化不受EGCG的影响。这些结果强烈表明，EGCG通过抑制成骨细胞中的SAPK / JNK途径抑制IL-6的PDGF-BB刺激的合成。

1.介绍

白介素-6 (IL-6)是一种多功能细胞因子，在促进b细胞分化、t细胞活化、诱导急性期蛋白等多种功能上具有重要的生理作用[1-4.］．一般认为，成骨细胞和破骨细胞这两种功能细胞严格调节骨代谢，前者负责骨形成，后者负责骨吸收[5.］．骨结构的形成和骨重建是这一耦合过程的结果;活化的破骨细胞吸收骨，随后成骨细胞沉积新的基质。在骨代谢中，人们普遍认为IL-6是最有效的破骨因子之一[3.那4.］．骨吸收是由局部炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-的增加介导的α.和IL-1。在成骨细胞[6.-8.]，有报道称骨吸收剂如肿瘤坏死因子-α.和IL-1刺激IL-6的合成。对于骨代谢，已显示IL-6刺激骨吸收并诱导破骨细胞形成[3.那4.那7.那9.］．因此，累积证据表明，从成骨细胞分泌的IL-6起到骨吸复膜剂的下游效应子的关键作用。已经证明，血小板衍生的生长因子-BB（PDGF-BB），众所周知的促致动因子增加增殖并抑制成骨细胞的分化[10.］．PDGF-BB还通过增加破骨细胞的数量来增强骨吸收，这一效果可以是IL-6表达的增加[10.那11.］．因此，PDGF-BB效应的调节可能成为骨质疏松症的治疗靶点。在我们最近的研究中[12.那13.，我们已经报道了PDGF-BB通过p44/p42 MAP激酶、p38 MAP激酶和应激活化蛋白激酶(SAPK)/c-Jun刺激IL-6合成N-terminal (JNK)， MAP激酶超家族成员[14.在成骨细胞样MC3T3-E1细胞中，Akt和p70 S6激酶抑制其合成。然而，PDGF-BB促进成骨细胞中IL-6合成的确切机制尚未阐明。

蔬菜、水果等食物中的化合物对人体有益。其中，有报道称黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤作用[15.那16.］．儿茶素是主要的黄酮类化合物之一，这些主要类化合物是绿茶等各种植物中的[16.］．在骨代谢中，儿茶素可以抑制骨吸收[17.］．至于骨核糖体，据报道（ - ） - EpigallocateChin gallate（egcg）诱导骨细胞凋亡[18.那19.]并抑制差异化[20.］．然而，据我们所知，EGCG对破骨细胞刺激或处理的成骨细胞中细胞因子或基质降解酶表达的影响尚未见报道。至于成骨细胞，已有研究表明儿茶素刺激碱性磷酸酶活性，这是一种成熟的成骨细胞表型[5.]，降低成骨样MC3T3-E1细胞凋亡[21.］．然而，儿茶素在成骨细胞中的确切作用机制尚不完全清楚。

在本研究中，我们研究了绿茶主要类黄酮之一的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是否影响pdgf - bb刺激的成骨细胞样MC3T3-E1细胞中IL-6的合成及其机制。我们在这里表明，EGCG通过减弱这些细胞中SAPK/JNK通路来减少pdgf - bb刺激的IL-6合成。

2.材料和方法

2.1。材料

重组PDGF-BB、IL-6 ELISA、骨钙素ELISA、骨保护素(OPG) ELISA试剂盒购自R&D Systems, Inc. (Minneapolis, Minn, USA)。EGCG由Calbiochem-Novabiochem Corp. (La Jolla, california, USA)获得。Phospho-specific PDGF受体β抗体，PDGF受体βp44/p42 mapkinase antibody、p44/p42 mapkinase antibody、p38 mapkinase antibody、phospho-specific SAPK/JNK kinase antibody、SAPK/JNK antibody、phospho-specific Akt antibody、Akt antibody、phospho-specific p70 S6 kinase antibody、和p70 S6 kinase antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, Mass, USA). ECL Western blotting detection system was purchased from Amersham Japan (Tokyo, Japan). Other materials and chemicals were obtained from commercial sources.

２.２.细胞培养

克隆的类成骨细胞MC3T3-E1细胞来源于新生小鼠颅骨[22.，维持如先前所述[23.］．简单地说，细胞被培养在α.- 最低基本培养基（α.-MEM)，含10%胎牛血清(FCS)^°在5% CO的湿化气氛中₂/ 95％的空气。将细胞接种成35毫米的菜肴（/盘）或直径为90毫米的菜肴（/盘)α.-MEM含10% FCS。5天后，介质被交换为α.-MEM含0.3% FCS。48小时后将细胞用于实验。

如前所述，原代培养的成骨细胞取自新生(1或2天)balb/c小鼠的颅骨[24.］．它们被播种成90毫米的菜肴（细胞)α.-MEM含10% FCS。培养基每3天更换一次，直到细胞在5天达到融合。然后，媒介被交换了α.-MEM含0.3% FCS。48小时后将细胞用于实验。

２.３.骨钙素、OPG和IL-6的测定

用载体或不同剂量的EGCG(1 ~ 30)预处理培养的细胞μ.M)培养24小时后，分别用ELISA试剂盒检测培养液中骨钙素和OPG的水平。用1 mL的PDGF-BB刺激培养细胞α.-MEM含0.3% FCS，然后孵育指定时间。收集条件培养液，用IL-6酶联免疫吸附测定培养液中IL-6的含量。当有需要时，用不同剂量的EGCG预处理细胞60分钟。

2.4。实时RT-PCR

培养的细胞用30次预处理 μ.M EGCG或载体60分钟，然后通过50ng / ml PDGF-BB刺激60分钟。分离总RNA并使用Trizol试剂和OmnQuck逆转录酶试剂盒转录成互补DNA。使用毛细管的轻循环系统（Roche Diagnostics Basel，瑞士）进行实时RT-PCR，并用套件提供Capillaries和FastStart DNA Master Sybr Green。根据SIMPSON等人的报告合成了感觉和反义引物。对于小鼠GAPDH mRNA [25.］．小鼠IL-6 mRNA的义、反义引物购自Takara Bio Inc. (Tokyo, Japan)(引物集ID:MA039013)。扩增产物采用熔融曲线分析和琼脂糖电泳检测。IL-6 mRNA水平与GAPDH mRNA水平归一化。

2．5．Western Blotting分析

通过PDGF-BB刺激培养的细胞α.-MEM含0.3% FCS的指示期间。用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次，然后在含有62.5 mM Tris/HCl、pH 6.8、2%十二烷基硫酸钠(SDS)、50 mM二硫苏糖醇和10%甘油的裂解缓冲液中裂解、均质和超声。离心后收集细胞质部分作为上清在×g上停留10分钟^°C.用Laemmli进行sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) [26.用10%聚丙烯酰胺凝胶。Western blotting分析如前所述[27.]通过使用磷酸特异性PDGF受体β抗体，PDGF受体βp44/p42 mapkinase antibody、p44/p42 mapkinase antibody、p38 mapkinase antibody、phospho-specific SAPK/JNK kinase antibody、SAPK/JNK antibody、phospho-specific Akt antibody、Akt antibody、phospho-specific p70 S6 kinase antibody、p70 S6激酶抗体与山羊抗兔IgG的过氧化物酶标记抗体作为第二抗体。采用ECL Western blotting检测系统在x射线上观察PVDG膜上过氧化物酶活性。当有需要时，用不同剂量的EGCG预处理细胞60分钟。

2.6。确定

酶免疫分析样品的吸光度在450 nm处用EL 340生物动力学阅读器(Bio- tek Instruments, Inc.， Winooski, Vt, USA)测定。密度分析使用Molecular Analyst/Macintosh (Bio-Rad Laboratories, Hercules, california, USA)进行。

2.7。统计分析

通过ANOVA分析数据，然后进行Bonferroni方法，用于对成对之间的多个比较和a被认为是显著的。所有数据都以平均数表示三次测定的扫描电镜。每个实验重复三次，结果是相似的。

3.结果

3.1。EGCG对PDGF-BB刺激的IL-6合成在MC3T3细胞和初级培养的小鼠成骨细胞中的影响

据报道，PDGF-BB在大鼠成骨细胞中诱导IL-6的转录[11.］．我们之前发现PDGF-BB刺激小鼠成骨细胞样MC3T3-E1细胞中IL-6的合成[12.］．我们首先检测了EGCG对pdgf - bb刺激的IL-6合成的影响。EGCG单独对IL-6水平影响不大，但可以显著降低pdgf - bb刺激的IL-6合成(图)1(a))。EGCG (30μ.m）降低PDGF-BB效应约为50％。此外，我们还研究了EGCG在初级培养的小鼠成骨细胞中的影响。PDGF-BB在原发性骨盆中显着增强IL-6合成（图1(b))。此外,EGCG (30μ.M)显著降低了pdbf - bb刺激的IL-6合成(图1(b))。然后通过台台蓝排除试验评估EGCG对细胞活力的影响。我们证实MC3T3-E1细胞在37^°C在30个存在下24小时 μ.与对照细胞相比，M细胞EGCG含量超过90%。为了确定EGCG是否会影响细胞增殖，我们用30孵育24小时后分别计数细胞数量μ.M EGCG。我们证实EGCG在剂量为30时不影响细胞数量μ.米( cells/mL for control;细胞/毫升30μ.在刺激期间测量24小时的M EGCG）。因此，egcg 30 μ.m几乎不会影响骨细胞的活力或骨质细胞样MC3T3-E1细胞的增殖，最长为24小时。

3.2。EGCG对MC3T3-E1细胞骨钙素和骨盆素水平的影响

接下来，为了确定EGCG是否影响这些细胞的分化，我们检查了EGCG对骨钙素合成的影响，成熟的成骨细胞表型[28.[骨盆素（OPG），由成骨细胞产生并抑制骨质细胞骨吸收[29.，在MC3T3-E1细胞中合成。我们发现EGCG对骨钙素没有影响(在实验条件下根本检测不到;<1.56 ng/mL)和OPG (196734 pg/mL的车辆;184646 pg / ml，30 μ.M的EGCG)合成。

3.3。EGCG对MC3T3-E1细胞中IL-6 mRNA的PDGF-BB诱导的表达水平的影响

为了阐明通过转录事件介导PDGF-BB刺激的IL-6合成的EGCG的抑制作用，我们通过实时RT-检查了EGCG对PDGF-BB诱导的IL-6 mRNA表达的影响。PCR。我们发现EGCG（30 μ.m）在刺激后60分钟显着下调IL-6 mRNA表达水平（图1(c))，表明EGCG的抑制作用至少部分是通过减少成骨细胞样MC3T3-E1细胞中IL-6的合成介导的。

3.4。EGCG对PDGF受体PDGF-BB诱导的自磷酸化的影响β在MC3T3-E1细胞

为了阐明EGCG在PDGF- bb刺激这些细胞中IL-6合成背后的抑制机制，我们接下来研究了EGCG对PDGF- bb诱导的PDGF受体自磷酸化的影响β．EGCG未能影响PDGF受体的PDGF-BB诱导的自磷酸化β（数字2）.这些结果引导我们推测EGCG效应对PDGF-BB刺激的IL-6合成的机制可以通过PDGF受体活化的下游介导。

3.5。EGCG对MC3T3-E1细胞中P44 / P42映射Kinase，P38 Map激酶或SAPK / JNK的PDGF-BB诱导的PDGF-BB诱导的磷酸化

在我们之前的研究中[13.，我们报道了PDGF-BB激活三种主要的MAP激酶，p44/p42 MAP激酶，p38 MAP激酶和SAPK/JNK，导致MC3T3-E1细胞中IL-6的合成。接下来，我们研究了EGCG对pdgf - bb诱导的p44/p42 MAP激酶、p38 MAP激酶或SAPK/JNK磷酸化的影响。EGCG不能影响pdgf - bb诱导的p44/p42 mapkinase或p38 mapkinase的磷酸化(图)3.（a）和3.(b))。相反，EGCG本身对SAPK / JNK的磷酸化水平影响不大，显着抑制了PDGF-BB诱导的SAPK / JNK磷酸化（图4.）.根据密度分析，EGCG (30μ.M)导致pdgf - bb效应减少约40%。

3.6。EGCG对PDGF-BB诱导的MC3T3-E1细胞Akt或p70 S6激酶磷酸化的影响

在我们以前的研究中[12.那13.，我们发现pdgf - bb激活的Akt和p70 S6激酶限制了MC3T3-E1细胞中IL-6的合成。为了研究EGCG对pdgf - bb刺激的IL-6合成的影响是否通过激活这些细胞中的Akt或p70 S6激酶介导，我们检测了EGCG对pdgf - bb诱导的Akt或p70 S6激酶磷酸化的影响。然而，EGCG对pdgf - bb诱导的Akt磷酸化无明显影响(图)5.(a))或p70 S6激酶(图5.(b))。

4。讨论

在本研究中，我们表明EGCG在成骨细胞样MC3T3-E1细胞中显着抑制了PDGF-BB刺激的IL-6 mRNA的合成和表达水平。我们发现EGCG在初级培养的小鼠成骨细胞中也减少了PDGF-BB刺激的IL-6合成。这些发现表明EGCG对PDGF-BB刺激的IL-6合成的抑制作用在克隆成骨细胞样MC3-E1细胞中不具有特异性，但在成骨细胞中是常见的。我们确认了egcg 30 μ.m几乎不会影响骨细胞的活力或骨质细胞样MC3T3-E1细胞的增殖，最长为24小时。至于EGCG对这些细胞分化的影响，结果表明EGCG对骨钙素和OPG合成没有影响。然而，已经表明，儿茶素刺激了碱性磷酸酶活性，成熟的成骨细胞表型[5.]，并减少成骨细胞样MC3T3-E1细胞中骨吸收细胞因子的产生[21.］．考虑到这些结果，建议EGCG可以部分地影响成骨细胞样MC3T3-E1细胞的分化。我们接下来研究了EGCG潜在抑制作用对IL-6合成的机制。众所周知，地图激酶超家族在细胞功能中起着至关重要的作用，包括各种细胞中的增殖，分化和生存期[14.］．三个主要地图激酶，p44 / p42 map激酶，p38 map激酶和sapk / Jnk称为哺乳动物细胞使用的中心元素，以转换各种消息[14.］．我们此前报道，SAPK / JNK作为MC3T3-E1细胞中PDGF-BB诱导的IL-6合成中的阳性调节剂[13.］．在本研究中，我们发现EGCG并不影响pdgf - bb诱导的p44/p42 MAP激酶或p38 MAP激酶的磷酸化。因此，EGCG似乎不可能通过下调成骨细胞样MC3T3-E1中p44/p42 MAP激酶或p38 MAP激酶的激活来降低pdgf - bb刺激的IL-6合成。另一方面，我们发现EGCG显著抑制pdgf - bb诱导的SAPK/JNK磷酸化。这些结果提示EGCG下调pdgf - bb刺激的SAPK/JNK的活化。考虑到我们的研究结果，EGCG最有可能通过下调成骨细胞样MC3T3-E1细胞中SAPK/JNK的激活来抑制pdgf - bb刺激的IL-6合成。儿茶素抑制成骨细胞IL-6合成的确切机制有待进一步研究。

我们以前表明AKT和P70 S6激酶对骨细胞样MC3-E1细胞中的PDGF-BB刺激合成的PDGF-BB刺激的合成[12.那13.］．我们还研究了Akt和p70 S6激酶在EGCG抑制IL-6合成中的作用。然而，EGCG没有影响pdgf - bb诱导的Akt或p70 S6激酶的磷酸化。因此，EGCG似乎不可能通过下调成骨细胞样MC3T3-E1细胞中Akt或p70 S6激酶的激活来抑制pdgf - bb诱导的IL-6合成。考虑到我们的研究结果，EGCG最有可能通过下调成骨细胞样MC3T3-E1细胞中SAPK/JNK的激活来抑制pdgf - bb刺激的IL-6合成。

由成骨细胞合成的IL-6调节多种骨细胞功能[3.］．在骨代谢中，从成骨细胞分泌的IL-6充当自分泌/旁碱因子，其诱导破骨细胞形成并刺激其活性以反射骨骼[4.那7.］．基于我们的研究结果，儿茶素诱导PDGF-BB抑制SAPJ/JNK活化可能通过下调成骨细胞IL-6的合成而抑制骨吸收。据报道，PDGF-BB被认为是成骨细胞增殖和胶原合成的有效刺激因子[30.］．PDGF在血小板聚集过程中释放，作为全身因子在骨折愈合中起关键作用，PDGF也作为局部因子调节骨重塑[30.］．至于骨质疏松症，先进国家的老年人健康状况中的一个主要问题之一，据报道，重组PDGF-BB的给药加速了老年，骨质疏松大鼠的骨折愈合[31.］．然而，本研究表明，PDBG-BB不仅由培养的原发性骨细胞刺激溶于溶血性骨吸收剂之一，而且仅由培养的初级成骨细胞刺激其中一种有效的骨复膜复血剂，而且仅由培养的原发性骨质细胞刺激IL-6合成，而且是由骨质细胞样MC3T3-E1细胞刺激。在本研究中，值得注意的是，EGCG在成骨细胞中降低了PDGF-BB刺激的IL-6合成。因此，我们现在的发现导致我们推测EGCG可以通过在成骨细胞中减少IL-6合成来增强PDGF-BB的断裂愈合特性。我们现在的数据将为儿茶素药理作用的新见解骨代谢。

EGCG在人体志愿者单次服用1 600 mg/d时的药代动力学表现为快速吸收，最大血药浓度为11.08μ.M (= 3392 ng/mL);达到最大血药浓度的时间为2.2小时，最终消除半衰期为1.9 ~ 4.6小时[32.］．有趣的是，口服EGCG 10天反复给药的剂量高达800mg /天，被发现是安全的，而且耐受性很好[33.］．在本研究中，我们表明，在10中清楚地观察到EGCG对PDGF-BB刺激的IL-6合成的显着抑制作用 μ.因此，最有可能喝足够的绿茶以达到我们在体外研究中使用的体内水平。此外，已经表明癌症预防或抗炎作用所需的EGCG等血浆浓度超过10 μ.米到50μ.米(34.-36.］．我们的结果，关于IL-6合成的抑制，与这些先前的发现一致。关于调节细胞内信号传导途径所需的EGCG的有效浓度，已知几乎令人难以知道。除了MC3T3-E1细胞外，使用初级培养的成骨细胞的进一步研究是必要的，以阐明儿茶素在骨代谢中的确切作用。

总之，我们的目前的结果强烈建议，儿茶素通过抑制成骨细胞中的皂孔/ JNK途径来抑制IL-6的PDGF-BB刺激的合成。

致谢

作者非常感谢Yoko Kawamura和Seiko Sakakibara，以其熟练的技术援助。这项调查部分由增长科学基础，科学研究（16590873和16591482）的资助，为日本的教育部，科学，体育和文化部进行助剂，研究赠款（15A-1,15C-2和17A-3），蛋白质组学的研究资助，以及日本卫生，劳工和福利部的骨折和黛凡岛的研究授予，以及来自增长科学基础的研究资助。

参考

1. S.Akira，T. Taga和T.Kishimoto，“生物学和医学中的白细胞介素-6”免疫学的发展，卷。54，pp。1-78,1993。视图:出版商网站|谷歌学者
2. D. Heymann和A.-v.Rousselle，“GP130细胞因子家庭和骨细胞”细胞因子，第12卷，第2期10，页1455-1468,2000。视图:出版商网站|谷歌学者
3. K.T. Steeve，P.Marc，T. Sandrine，H. Dominique和F. Yannick，“IL-6，Rankl，TNF-alpha / IL-1：骨吸收患者的相互关系，”细胞因子与生长因子综述，卷。15，不。1，pp。49-60,2004。视图:出版商网站|谷歌学者
4. H. C. Blair，L. J. Robinson和M. Zaidi，“Osteoclast信号传导途径”生物化学和生物物理研究通信，第328卷，第328号3，页728-738,2005。视图:出版商网站|谷歌学者
5. P. J. Nijweide, E. H. Burger和J. H. M. Feyen，《骨细胞:增殖、分化和激素调节》，生理上的评论第66期4，第855-886页，1986。视图:谷歌学者
6. M. Helle, J. P. J. Brakenhoff, E. R. De Groot, and L. A. Aarden，“白介素6参与白介素1诱导的活动”，欧洲免疫学杂志，卷。18，不。6，pp。957-959,1988。视图:出版商网站|谷歌学者
7. Y.Ishimi，C.Miyaura，C.H.Jin等，“IL-6是由成骨细胞产生的，诱导骨吸收，”免疫学杂志，卷。145，没有。10，pp。3297-3303,1990。视图:谷歌学者
8. A. J. Littlewood, J. Russell, G. R. Harvey, D. E. Hughes, R. G. G. Russell, M. Gowen，“IL-6及其受体在体外人类成骨细胞中的表达的调节”，内分泌学，卷。129，没有。3，PP。1513-1520,1991。视图:谷歌学者
9. g·d·鲁德曼，《展望:白细胞介素6:一种骨生长因子?》骨矿物研究杂志，第7卷，第5期5，第475-478页，1992年。视图:谷歌学者
10. E. Canalis，“骨骼生长因子”骨质疏松症， R. Marcus, Ed.， P529-P546, Elsevier学术出版社，Burlington，马萨诸塞州，美国，第3版，2008。视图:谷歌学者
11. N. Franchimon, D. Durant, S. Rydziel和E. Canalis，“血小板衍生生长因子通过激活蛋白-1复合物和激活转录因子-2诱导成骨细胞中白细胞介素-6的转录，”生物化学杂志第274期10、1999年。视图:出版商网站|谷歌学者
12. Y. Hanai, H. Tokuda, T. Ohta, R. matsusima - nishiwaki, S. Takai, O. Kozawa，“磷脂酰肌醇3激酶/Akt在成骨细胞中自动调节pdgf - bb刺激的白细胞介素-6合成”，细胞生物化学杂志，第99卷，第5期。6、2006年。视图:出版商网站|谷歌学者
13. S. Takai, H. Tokuda, Y. Hanai, O. Kozawa，“血小板来源的生长因子bb诱导的白介素6合成在成骨细胞样MC3T3-E1细胞中的p70 S6激酶的限制”，新陈代谢，卷。56，没有。4，pp。476-483，2007。视图:出版商网站|谷歌学者
14. J.M.Kyriakis和J.Avruch，“哺乳动物丝裂原激活的蛋白激酶信号转导途径由应力和炎症激活”生理上的评论第81卷第1期2，第807-869页，2001。视图:谷歌学者
15. J. Jankun，S. H. Selman，R. Swiercz和E. Skrzypczak-Jankun，“为什么喝绿茶可以预防癌症，”自然，卷。387，没有。6633，p。561,1997。视图:出版商网站|谷歌学者
16. J. B. Harborne和C. A. Williams，“自1992年以来类黄酮研究的进展”，植物化学，第55卷，第55期6，页481-504,2000。视图:出版商网站|谷歌学者
17. J. M. Delaisse, Y. Eeckhout，和G. Vaes，“(+)儿茶素抑制培养中的骨吸收”，生物化学药理学第35期18，第3091-3094页，1986。视图:出版商网站|谷歌学者
18. 中川，M. Wachi, j . t。Woo等人，“Fenton反应主要参与(3)-表没食子儿茶素-3没食子酸酯诱导破骨细胞死亡的机制，”生物化学与生物物理研究通信，卷。292，没有。1，pp。94-101,2002。视图:出版商网站|谷歌学者
19. J.-H.云，C.0.。金，k。。CHO，J.K.柴，C.K.金，和s。 -choi，“（ - ） - Epigallocatechin gallate通过Caspase活化诱导细胞凋亡，在骨缩合中，在骨溶酶的疏松骨糖中，从原料264.7细胞分化，”牙周研究杂志，卷。42，不。3，第212-218,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
20. A. Morinobu, W. Biao, S. Tanaka et al.，“(-)-表没食子儿茶素-3没食子酸酯抑制破骨细胞分化并改善小鼠实验性关节炎”，关节炎和风湿病，卷。58，不。7，pp。2012-2018，2008。视图:出版商网站|谷歌学者
21. E.-M.Choi和J.-k.Hwang，“（+） - 儿茶素对骨细胞功能的影响”，“生物与制药通报第26卷第2期4，页523-526,2003。视图:出版商网站|谷歌学者
22. H.Sudo，H. A. Kodama，Y.Amagai，Y. Yamamoto和S. Kasai，“在新生儿小鼠Calvaria的新克隆成骨细胞系中的体外分化和钙化”细胞生物学杂志，卷。96，没有。1，pp。191-198,1983。视图:出版商网站|谷歌学者
23. O. Kozawa，A.铃木，H. Tokuda和T. Uematsu，“前列腺素${\text{F}}_{2_{\mathrm{\alpha .}}}$通过激活成骨细胞样细胞中的PKC来刺激白细胞介素-6的合成，”美国生理学杂志第272期2, pp. 208 - e211, 1997。视图:谷歌学者
24. M. Yoshida，M. Niwa，A.Ishisaki等，“甲氨蝶呤增强了前列腺素D2刺激的热休克蛋白27诱导在成骨细胞中，”前列腺素、白三烯和必需脂肪酸，第71卷，第71期6，页351 - 362,2004。视图:出版商网站|谷歌学者
25. D. a . C. Simpson, S. Feeney, C. Boyle, and a . W. Stitt，“SYBR Green I荧光法测定视网膜VEGF mRNA:一种通用的定量PCR方法”，分子的愿景，第6卷，第2期24，页178-183,2000。视图:谷歌学者
26. uk Laemmli，“T4噬菌体头部组装过程中结构蛋白的切割”，自然号，第227卷。5259页，680 - 685,1970。视图:出版商网站|谷歌学者
27. K. Kato, H. Ito, K. Hasegawa, Y. Inaguma, O. Kozawa, T. Asano，“应激诱导合成hsp27和$\mathrm{\alpha .}$环磷酸腺苷在C6大鼠胶质瘤细胞中的作用神经化学杂志第66期3，第946-950页，1996。视图:谷歌学者
28. P. Ducy, C. Desbois, B. Boyce等，“骨钙素缺乏小鼠的骨形成增加”自然，第382卷，第2期1996年。视图:出版商网站|谷歌学者
29. S. Khosla，“Minieview：OPG / Rankl /秩系统”，内分泌学，第142卷，第2期。12，页5050-5055,2001。视图:出版商网站|谷歌学者
30. E. Canalis, S. Varghese, T. L. McCarthy, M. Centrella，“血小板衍生生长因子在骨细胞功能中的作用”，增长监管，第2卷，第2期4，第151-155页，1992。视图:谷歌学者
31. J. O. Hollinger, A. O. Onikepe, J. MacKrell等人，“重组人血小板来源的生长因子- bb和可注射的-磷酸三钙/胶原基质加速老年骨质疏松大鼠骨折愈合”骨科研究杂志第26卷第2期1，第83-90页，2008。视图:出版商网站|谷歌学者
32. U. Ullmann，J.Haller，J.P.Cocourt等，“Epigallocatechin的单一上升剂量研究，健康志愿者，”国际医学研究杂志第31卷第1期2，页88-101,2003。视图:谷歌学者
33. U. Ullmann, J. Haller, J. D. Decourt, J. Girault, V. Spitzer, and P. Weber, “Plasma-kinetic characteristics of purified and isolated green tea catechin epigallocatechin gallate (EGCG) after 10 days repeated dosing in healthy volunteers,”国际维生素和营养研究杂志，卷。74，没有。4，pp。269-278,2004。视图:出版商网站|谷歌学者
34. J.D.Lambert和C.S. Yang，“茶叶成分的癌症预防机制”营养杂志，卷。133，不。10，PP。3262S-3267S，2003。视图:谷歌学者
35. D. S. Wheeler, J. D. Catravas, K. Odoms, a . Denenberg, V. Malhotra，和H. R. Wong，“表没食子儿茶素-3-没食子酸酯，绿茶衍生的多酚，抑制IL-1$\beta$- 培养呼吸上皮细胞中依赖的促炎信号转导，“营养杂志，卷。134，不。5，pp。1039-1044,2004。视图:谷歌学者
36. O. Aktas, T. Prozorovski, A. Smorodchenko et al，“绿茶表没食子儿茶素-3没食子酸酯介导T细胞NF-$？$B抑制和施加自身免疫性脑髓炎的神经保护作用，“免疫学杂志，卷。173，不。9，pp。5794-5800，2004。视图:谷歌学者

版权

版权所有©2008 Shinji Takai等。这是分布下的开放式访问文章创意公共归因许可证，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。