发烧的重要性是宿主单核细胞释放促炎和抗炎介质的效力的预测症状

抽象的

客观的．澄清是否从发烧开始的时间延迟作为败血症的第一迹象可能指示单核细胞释放促炎和抗炎介质的效力。方法．单核细胞与51例脓毒症患者和9例健康供体的血液中分离出来。在没有患者血清的情况和存在的情况下孵育单核细胞和肿瘤坏死因子-α的浓度（TNF)、白细胞介素(IL)-6、IL-10和丙二醛(MDA)检测。将患者分为三组:A组:12小时;B组:12-24小时，C组:发烧和血液取样之间的24小时。结果．TNF.B、C两组上清中IL-6、IL-10、MDA含量均高于对照组，A、C两组上清中IL-6、IL-10、MDA含量均高于对照组。出现症状的时间与在患者血清中培养的单核细胞上清中的IL-6呈负相关。幸存者的中位IL-6高于非幸存者。结论．单核细胞在出现与脓毒症相关的发热的最初24小时内具有释放促炎和抗炎介质的能力;血清刺激IL-6在前12小时内进一步释放。

1.介绍

尽管有关败血症发病机制的知识，但其死亡率仍然很高，使欲望南欧和美国北部的第九次死因仍然很高1］．脓毒症发病率的增加引起了人们对各种治疗策略的关注。在这些策略中，免疫疗法得到了发展。其中包括针对肿瘤坏死因子- α (TNF)的抗体）和内毒素，可溶性受体其中，血浆血液透析、一氧化氮合酶抑制剂和活化蛋白c等药物在II期临床试验中获得了成功，但在III期临床试验中，这些药物要么失败，要么被证明存在问题[2那3.］．已经提出了各种假设来解释免疫治疗的失败。最重要的似乎是缺乏对败血症发病机制的深入了解[4.］．目前的发病机理理论是基于细菌产物刺激血液单核细胞后产生促炎和抗炎细胞因子，免疫治疗往往针对这些介质。然而，在所有临床试验中，在任何研究产品开始时，在不完全了解宿主免疫状况的情况下，在满足某些登记标准的情况下进行治疗[4.］．

通过实验研究强调了在促炎介质达到其峰值达到峰时的时间段的重要性[5.］．为达到临床领域，必须能够将症状的存在与免疫系统的功能相关联。脓毒症患者的单核细胞通常被丧失，即它们在被细菌产品刺激时产生有限的促炎介质[6.］．然而，目前尚无数据表明脓毒症患者的单核细胞在体外转移时是否能够产生促炎和抗炎介质。本研究试图提供这些信息，并将单核细胞中介质的体外释放与脓毒症最初症状发热的时间间隔联系起来。

2.患者和方法

2.1。患者的特征

2003年1月至9月期间，在雅典" Sismanoglion "总医院第四内科进行了登记。该议定书得到了Sismanoglion总医院伦理委员会的批准;获得患者或一级亲属的书面知情同意。所有急诊连续入院的患者都有资格参加这项研究。

包含标准是（a）发烧的存在定义为大于38的体温^°c是潜在感染的第一个症状，（b）以下潜在的潜在感染之一：较低呼吸道感染，腹部感染或急性肾盂肾炎，（c）败血症，严重脓毒症或脓毒症。排除标准是：（a）艾滋病毒感染，（b）中性粒细胞病症定义为较少1000个中性粒细胞/L，以及(c)摄入皮质类固醇，剂量大于或等于1毫克/公斤当量强的松，持续一个月以上。

降低呼吸道感染被定义为下列所有情况的存在[7.:(a)核心温度> 38^°C、(b)新的或增加的咳嗽，(C)新的或增加的脓痰产生;(d)胸片上有新的浸润。

IntraMnaminal感染被定义为下列所有情况的存在[8.:(a)核心温度> 38^°C， (b)深触诊疼痛，(C)符合腹腔内感染的影像学表现，(d)白细胞> 12,000/l或<4,000 /l或> 10％的频带形式。

急性肾盂肾炎被定义为存在以下所有症状[9.:(a)核心温度> 38^°C，（b）腰痛或放射学发现与急性肾盂肾炎相容，（c）超过10个白细胞pHF的离心尿液。

脓毒症被定义为感染伴有以下至少两种情况[10]：（a）体温大于38^°C、(b)呼吸频率高于20次/分钟或<32mmH，（c）心率超过90次/分钟/分钟，（d）白细胞> 12,000或<4,000 /L或10%以上波段。

由于潜在的感染，严重败血症被至少一个器官的急性功能障碍，即至少有一个机构的急性功能障碍，即急性呈现以下至少一个[10]：

（一世）急性呼吸窘迫综合征(ARDS): pO₂/ fio.₂200以下肺x线表现为双侧弥漫性阴影;(2)急性肾衰竭:在恢复体液负平衡的情况下，尿量小于0.5 mL/Kg体重/h至少2小时;（iii）代谢酸中毒：pH <7.30或任何大于5meq / L的碱缺损，血清乳液至少超过2倍的正常值;（iv）急性凝血病:血小板计数< 100.000/L或INR > 1.5。

脓毒症休克定义为败血症合并收缩压低于90mmhg超过1小时，在纠正患者体液负平衡的前提下需要使用血管加压药[10］．

在开始任何抗菌素治疗前，在无菌条件下穿刺外周静脉后，从每个患者采集25 mL全血;将20 mL收集到肝素包被无菌管中(Becton Dickinson, Coskeysville, Md, USA)，其余的收集到无菌管中。后者被离心，血清保持在-70^°C直到测定。

对每个患者记录以下信息:年龄、性别、开始发烧到采血的时间间隔以及APACHE II评分和结果。发烧的确切时间由病人的病史提供。不可靠的患者不被认为是合格的。

2.2。实验室技术

对于外周血单个核细胞(PBMCs)的分离，肝素化静脉血在Ficoll Hypaque (Biochrom, Berlin, Germany)上分层并离心。分离的单个核细胞用PBS (pH 7.2)洗涤三次，并在100 U/mL青霉素G和0.1 mg/mL链霉素(Sigma-Aldrich, Miss, USA)的存在下重悬于含2 mM谷氨酰胺(Biochrom)的RPMI 1640中。37℃孵育1小时后^°5% CO中的C₂除了用Hank的溶液洗涤粘附的单核细胞三次粘附单核细胞的同时除去非相继细胞。然后将细胞收获0.25％胰蛋白酶/ 0.02％EDTA（Biochrom），并在台盼蓝排除后在Neubauer板上计数。它们的单核细胞中的纯度超过95％，如氟核科·菲尔（Immunotech，Marseille，France）的抗CD14单核抗体孵育和EPIC / XL流量细胞仪分析（Beckman Coulter Inc.，Miami，FL，美国）使用IgG-FITC染色的细胞作为阴性对照。

用冰冷的细胞裂解缓冲液（50mM HEPES，0.1％CHAPS，5mM DTT，0.1mM EDTA，pH7.4）处理一半的细胞。离心10分钟以上的10分钟4分钟^°C，通过酶显色法(BIOMOL Research Laboratories, Plymouth, Pa, USA)估计胞浆提取物中caspase-3的活性。它是基于水解速率在37^°通过在410nm处的顺序光度测定的评估，剥离p-nitaniline加管底物的C.该测定也在Caspase-3抑制剂存在下进行。细胞提取物中Caspase-3的活性表示为pmol / min10^4.细胞。

其余一半的单核细胞分布在12孔板的两个孔中，每个孔的体积为2.4 mL, RPMI 1640中添加2mm的谷氨酰胺。它们是在没有或有100个的情况下孵化的L，因此添加的血清占总孔体积的4.1%。在37^°5% CO以下的碳₂，将板离心并将上清液保持在-70^°C直到测定。从九个健康供体中分离的单核细胞并仅在没有血清的情况下孵育作为对照。

浓度，白细胞介素（IL）-6和IL-10估计在血清和上清液中，通过酶免疫吸附测定（锥形，巴黎，法国）。测定的较低检测限为1.5 pg / mlIL-6为6.25 pg/mL, IL-10为12.5 pg/mL。它们在单核细胞上清中的浓度表达为pg/10^4.细胞。

如前所述，通过MDA浓度测定血清和上清液中的脂质过氧化[11］．简而言之，将0.1ml等份的每个样品混合至0.9ml三氯乙酸20％（默克）并以12,000g和4离心。^°c 10分钟。除去上清液并用2ml硫氨基吡啶酸0.2％（梅克）温育60分钟^°C.离心后体积为10L上清液注入高效液相色谱系统(HPLC, Agilent 1100 Series, Waldbronn, Germany)，洗脱特征如下:Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6150毫米,5m）37以下的列^°C;流动相由50毫米K组成_3.阿宝_4.(pH: 6.8)缓冲液与甲醇以60/40的比例为99%，流速为1 mL/min;在515 nm激发和535 nm发射信号的荧光检测。MDA的保留时间为3.5分钟，由默克公司(Merck)用1,1,3,3 -tetramethoxy-propane建立的标准曲线估计。所有测定都是重复进行的。浓度表示为mol/mL血清和mol / 10.^4.上清液的细胞。

２.３.统计分析

结果表达为中位数和95％的置信区间（CI）或作为狭隘的范围（IQR）。出于分析的目的，根据发烧和血液采样的开始之间的时间间隔分为三组：A组：<12小时，B组：12至24小时，C组，> 24小时开始发热。曼诺 - 惠特尼用Bonferroni校正进行了组之间的比较;Wilcoxon试验在血清缺失与存在之间的产生浓度的比较。根据Spearman的订单等级进行了从采样和细胞因子浓度之间的时间间隔之间的相关性。任何价值P.低于0.05被认为是显著的。

结果

在入学期间，54名患者有资格。五十人最终招生，因为只有在他们发烧中是潜在感染的第一个症状。这些患者的人口特征如表所示1．痰培养未发现任何病原体。

A组13例，B组16例，c组22例血清IL-6、IL-10、MDA含量与时间间隔的关系见表2．时间间隔组间无差异。

浓度无论与对照相比，无需存在的单核细胞上清液的IL-6，IL-10和MODA的单核细胞上清液的MDA，与对照相比，从采样开始的发烧时间间隔1．A、C组IL-6水平高于对照组，A、B组IL-10水平高于对照组，A组MDA水平高于对照组。

血清对介质释放的影响如图所示2．A组患者单核细胞上清IL-6加入患者血清后升高(P.= .018)。B组的MDA (P.= 0.049 and C (P.= .048)。A组在患者血清存在下生长的单核细胞上清中IL-6高于B组(P.= .037）和c（P.= .048)。

Caspase-3的中位数（IQR）活性为53.5（295.5）pmol / min10^4.A组的细胞，200（2020）pmol / min10^4.99.6 (1642) pmol/min10^4.C组的细胞(组间的pNS)。

在患者血清存在下培养的单核细胞上清液的症状和IL-6之间的时间之间发现了负相关性（那P.= .041,图3.)．没有发现其他显着的相关性。

幸存者单核细胞上清液中位数（IQR）IL-6为41.9（149.2）PG / 10^4.1.9 (67.8) pg/10^4.Nonsurvivors的细胞（P.= .048)。分别为51.6(96.0)和37.8 (30.0)pg/10^4.（PNS）。没有发现浓度的差异、IL-10和MDA在存活者和非存活者单核细胞上清中的表达。

4.讨论

尽管现有的血清标记提供的信息提供了特异性，但尚不能预先预测入侵紧急情况的脓毒患者的免疫功能。这是一种重要的重要性，因为源自动物模型的数据强调，需要了解哪个免疫反应，以便施用适当类型的免疫疗法[5.那12］．尽管有各种各样的研究提供了关于动物中败血症级联事件的顺序的深入知识[4.[是否存在人类情况的各种缺点。本研究试图在发烧的出现前的各种时间间隔内将脓毒宿主的单核细胞单核细胞单核细胞释放的效力与潜在化脓性过程的初始症状的初始症状相关联。据我们所知，以前从未描述过类似的尝试。

结果表明，脓毒症患者的单核细胞最有效地释放，IL-6，IL-10和MDA相比，发烧到来时的前24小时内与健康供体相比（图1)．这些发现表明，脓毒症宿主单核细胞在体外环境中仍能释放各种介质。单核细胞可能已经在其化粪池环境中准备好进行这种生产。

单核细胞的介质释放模式不是普遍存在的，因为MDA主要是早期分泌，和IL-6的早期和晚期都与开始发烧有关。也许只有IL-6可以得出安全的结论，主要有两个原因:(a)用患者血清刺激单核细胞，只有在发热后12小时内分离的单核细胞才会进一步释放IL-6(图)2)， (b)发热开始的时间延迟与单核细胞血清刺激释放IL-6之间存在负相关(图)3.)．

可能是患者血清诱导IL-6的潜在机制是不知道的，并且只能做出假设。血清细胞因子似乎并不责任，因为他们的水平在来自发烧的出现时不同时间间隔取样的血清之间没有差异（表2)．此外，单核细胞的caspase-3活性与出现发热的时间间隔相似，因此不能假设单核细胞的内源性惰性是罪魁祸首。无论其潜在机制是什么，该观察的临床意义在于，在发热的最初12小时内，脓毒症宿主的单核细胞嵌入在一个促进IL-6释放的环境中(图)2)．这种环境似乎是感染性病人预后的主要决定因素。尽管入组患者的死亡人数较低，但存活患者的IL-6体外释放高于非存活患者。这种差异在刺激后不再存在，这表明血清的存在引发了非幸存者单核细胞中IL-6的显著释放。当考虑到动物研究的数据时，后一项发现变得特别重要。在小鼠实验性腹膜炎中，立即给药亚胺培南可显著降低死亡率，只有血清中IL-6浓度非常高的动物例外[13］．

本研究的结果与脓毒症动物模型的研究结果基本一致。小鼠早期脓毒症伴随高血清浓度的促炎和抗炎细胞因子，而在晚期脓毒症中发现低血清浓度[14］．在同样的背景下，体外释放在发烧出现时，静脉内宿主的单核细胞的单核细胞中的IL-6和IL-10更大。

总之，我们的数据显示，发烧可能是对脓毒症宿主免疫功能的症状预测。单核细胞在出现发烧的24小时内具有释放促炎和抗炎介质的能力;患者血清在最初12小时内刺激IL-6进一步释放。这些发现与实验和临床结果基本一致，即作为抗生素，应尽早在败血症宿主中使用[15那16]，免疫调节治疗可能是必要的。

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