达尔贝草苷通过抑制TGF-改善阿霉素诱导的肾纤维化β信号途径

摘要

研究了黄芪中提取的著名天然产物达尔贝草苷(DAL)的作用Uraria crinita多柔比星- (DXR-)诱导小鼠肾纤维化。用DAL预处理7 d后，尾静脉单次注射DXR (10 mg/kg)。对DXR治疗后5周的肾功能进行分析。DXR引起肾毒性。DAL治疗后肾病综合征症状明显改善。肾纤维化指数、Smad3磷酸化及α -平滑肌肌动蛋白(α- sma)、纤维连接蛋白、胶原III (Col III)、E-cadherin、TGF-β，以及对DXR反应的Smad7均经过DAL相似的修饰。目前的研究结果表明，DAL改善了dxr诱导的实验性肾毒性模型中肾脏损伤的标志物。

1.介绍

阿霉素(DXR)是一种蒽环类糖苷类抗生素，对多种人类实体肿瘤有广谱抗肿瘤活性，如卵巢癌、乳腺癌和肺癌，以及几种其他癌症和血液系统恶性肿瘤[1- - - - - -3.]。但DXR并不区分癌细胞和正常细胞，不仅能清除快速生长的癌细胞，还能清除体内其他快速生长的细胞;因此，它在化疗中的应用受到了限制。DXR有多种毒性，包括心脏、肝脏、肾脏和血液学毒性[4- - - - - -8]。尽管DXR严重细胞毒性的机制尚不完全清楚，但活性氧(ROS)可能是一个关键因素。了解控制这种氧化损伤的事件是非常重要的。DXR处理导致羟自由基、过氧化氢和超氧阴离子过量生成，导致膜脂过氧化[9]。因此，越来越多的数据表明DXR和一种抗氧化剂同时治疗可以减轻DXR的毒性。

Uraria海百合化石在印度、泰国、印度尼西亚和中国广泛分布。它长期以来被用作草药，具有生物活性，如抗氧化活性，抗溃疡作用和成骨活性。由于其抗炎活性，它的根也被用来治疗寒战、水肿和胃痛[10，11]。本研究的目的是探讨黄芪花青素(Dalbergioidin, DAL)的作用Uraria crinita对dxr诱导的小鼠肾纤维化的影响。本研究旨在确定DAL治疗是否能在体内对抗DRX诱导的肾纤维化。我们还研究了DAL的作用机制。

2.方法

2．1.试剂

DAL购自BioBioPha Co.， Ltd。SMAD3、p-SMAD3 SMAD7,α- sma、纤维连接蛋白、Col I、E-cadherin、TGF-β均购自Santa Cruz Biotechnology, Inc。牛血清白蛋白(BSA)、DXR、氢氧化钠、硝酸铁、三氯乙酸(TCA)和高氯酸(PCA)。

２.２.动物

小鼠被容纳并如前所述使用[12]。

2.3。实验程序

将小鼠随机分为3组，每组8只。对照组42 d。ⅱ组为模型组，第7天给予DXR单次静脉注射(10 mg/kg);ⅲ组为处理组，给予DAL (30 mg/kg IP)预处理42 d;第7天给予DXR单次静脉注射(10 mg/kg)。第42天，采用颈脱位法处死小鼠，灌注后取肾脏和血液标本测定各生化指标。

２.４.尿液和血浆的测量

如前所述收集尿液和血液样品[13]。尿液白蛋白，血浆甘油三酯水平，血浆尿素水平和血清肌酐水平的测定使用商业试剂盒，酶联免疫吸附测定试剂盒(Exocell)，尿素氮直接试剂盒(Stanbio实验室)，LabAssay甘油三酯酶联免疫吸附测定试剂盒(Wako)，和肌酐液体色素试剂盒(Stanbio实验室)。

2．5．Masson-Trichrome染色

马尾松三色染色如前所述[14]。

2.6。体内谷胱甘肽的测定

在制造商的协议之后，使用商业套件（Cayman Chemical Co.）评估DAL处理对谷胱甘肽（GSH）水平的影响。

2.7。体内MDA水平的测定

通过测量涉及硫氨基脲酸（TBA）加合物的比色法测量丙二醛（MDA）水平来研究肾组织的脂质过氧化。MDA由商业TBARS测定套件（Cayman Chemical Co.）遵循制造商的议定书来衡量。

2.8。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

使用TRIzol试剂试剂盒(Invitrogene)从细胞中分离总RNA;用分光光度法测定RNA浓度。根据制造商的说明(Takara，日本)进行第一次cDNA合成。纤维连接蛋白的特异性引物，α- sma, E-cadherin, Col III, SMAD7, TGF-β， GAPDH(负荷对照)分别为:

纤连蛋白:义5 ' -CGAGGTGACAGAGACCACAA-3 '，反义5 ' -CTGGAGTCAAGCCAGACACA-3 ';α-SMA:义5 ' -TGTGCTGGACTCTGGAGATG-3 '，反义5 ' -ATGTCACGGACAATCTCACG-3 ';E-cadherin:义5 ' -AATGGCGGCAATGCAATCCCAAGA-3 '，反义5 ' -TGCCACAGACCGATTGTGGAGATA-3 ';Col III:义5 ' -AGGCAACAGTGGTTCTCCTG-3 '，反义5 ' -GACCTCGTGCTCCAGTTAGC-3 ';smad7: 5“-AGGTGTTCCCCGGTTTCTCCA-3”感觉;反义:5“-TTCACAAAGCTGATCTGCACGGT-3”;TGF -β：感觉5'-gcaacatgtggaactctaccaga-3'，反义5'-gacgtcaaaagacagccactca-3';GAPDH：感觉5'-aacttggcattgtggaag-3'，反义5'-acacattgggggggtaggaaca-3'。该方案如下：50℃，2分钟，95℃，10分钟，40个循环为95℃，15秒，60℃，30秒。

2.9。免疫印迹分析

如前所述使用western blotting方法[12]，组织均质，倒出上清。首先加入抗体，在4°C的膜中孵育过夜。酶标二抗稀释后与膜在20℃下孵育。然后用化学发光底物(Millipore)孵育印迹，并暴露于柯达胶卷。

2.10。ELISA试验

TGF -β用TGF-β酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA)

2.11。统计分析

各组之间的差异由Student 's进行分析-测试。所有数据点都呈现为均值的治疗组的平均值±标准偏差（SD）。值小于0.05被认为是显著的。

3.结果

3．1.DAL对肾功能不全的影响

如图所示1(一)，注射DXR后小鼠24小时尿蛋白排泄进行性增加。第21天，dxr组小鼠尿蛋白明显高于对照组。从第28天开始，dxr组小鼠尿蛋白迅速升高。在第5和第6周，DAL治疗显著降低了尿蛋白。dxr治疗的小鼠出现了严重的高脂血症(血浆甘油三酯mg/mL)，在治疗组(血浆甘油三酯)较轻 mg/mL) (Figure1 (b)）.与对照组相比，用DXR处理小鼠的小鼠均显着增加2.3-10倍，分别为2.3-10倍（图1 (c)和1 (d)）.用DAL预处理7天可使BUN和血浆肌酐恢复到接近控制水平(）.因此，DAL可减轻DXR模型小鼠的肾毒性。

３．２．DAL对肾纤维化的影响

像许多其他器官系统一样，肾脏后肾脏僵硬，一个过程越来越被认为是肾纤维化的重要驾驶员[15]。为了将肾损伤的减轻与药物治疗的效果联系起来，通过Masson染色评估肾纤维化(图)2(一个)）.-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白和上皮细胞标记物E-cadherin的western blot检测[16，17]。与白蛋白尿数据一致，DXR小鼠的结果显示出明显的肾纤维化，这证明了成纤维细胞标记表达的增加（图2 (b)- - - - - -2 (d)）.用DXR处理小鼠引起了众所周知的成纤维细胞标记物的肾蛋白表达的显着增加，并增加了肾组织中E-Cadherin的表达（图2 (b)- - - - - -2 (d)）.DAL可改善DXR模型小鼠的肾纤维化。

３．３．DAL对肾脏氧化还原电位的影响

活性氧(ROS)的产生升高是dxr诱导的细胞毒性的主要机制[18，19]。MDA和GSH用于评估ROS水平。在本研究中，DXR组肾脏中MDA含量较对照组明显升高(）.与DXR组比较，DXR诱导的肾毒性小鼠经DAL处理后，MDA水平显著降低(图)3(一个)）.我们还测量了GSH浓度作为肾脏组织细胞氧化还原状态的指标，以研究DAL的抗氧化作用。DXR治疗后，GSH水平明显下降，如图所示3 (b)（）.与DXR组相比，接受DAL的组显示出显着逆转的GSH耗尽。这表明DAL保持肾组织的氧化还原平衡。

3.4。DAL对TGF的影响β信号通路

TGF -β是肾纤维化发病机制的关键媒介，主要通过激活其下游Smad信号通路诱导肾瘢痕形成[20.]。尽管TGF -β信号通路由Smad2和Smad3介导，Smad2保护tgf - β /Smad3介导的肾纤维化[21]。因此，磷酸化的Smad3是TGF-的效应体β介导肾纤维化。DXR增加肾脏中Smad3磷酸化水平(图)4(一)）.如图所示4(一)，与DXR组相比，dal处理组SMAD3磷酸化水平显著降低(）.由于collagen III是TGF-beta/SMAD3的靶基因，我们通过q-PCR和western blotting检测肾脏中collagen III的mRNA和蛋白表达。如图所示4 (b)和4（c），与DXR组相比，dal处理组胶原III mRNA和蛋白水平显著降低。Smad7是TGF-的拮抗剂β通过阻止R-Smads与其受体相互作用或与Co-Smads竞争生成R-Smad/Co-Smad复合物[22，23]。DXR处理后Smad7 mRNA和蛋白水平降低，但DAL处理后Smad7 mRNA和蛋白水平降低(；数据5（a）和5（b））.DAL抑制TGF-β肾组织中的信号通路。

3．5．DAL对TGF-的影响β蛋白表达

TGF -β是一种在大多数细胞中控制增殖、细胞分化和其他功能的蛋白质。TGF -β对于肉纤维化和常态与炎症性疾病的慢性阶段相关的EMT是重要的[24]。如图所示6， TGF-的mRNA和蛋白水平β在DAL治疗组中，与DXR处理基团中的那些相比，显着降低。

4.讨论

在本研究中，DAL可改善DXR致小鼠严重肾病综合征。尿白蛋白、血浆尿素和肌酐是肾脏损伤诊断中最敏感的肾毒性标志物[25，26]。DXR治疗显着增加了血清肌酐，面包和高脂血症。相反，用DAL处理导致DXR处理的动物中这些参数的显着降低。这些结果表明，DAL可以针对DXR毒性提供相当大的肾脏保护作用。

肾纤维化是众所周知的dxr肾病肾衰竭的原因[27]。一些细胞途径，包括成纤维细胞激活和小管上皮-间质转化，已经被确定为肾纤维化的主要原因[28]。在本研究中，给予DAL可显著改善肾纤维化。在这个模型中，保护DAL的主要机制之一是抑制成纤维细胞的活化。注射DXR 35 d后，纤维连接蛋白和α-SMA mRNA和蛋白水平显著上调，DAL显著抑制其表达。我们还检测了上皮标记物E-cadherin的mRNA和蛋白水平。DAL治疗逆转了E-cadherin的下降。组织学上与这些结果一致，DAL治疗改善了dxr诱导的肾纤维化。

TGF -β，在一些研究中上调，在肾纤维化小管上皮-间充质转化的进程中起关键作用;针对TGF-的治疗干预β在动物模型中获得了成功和良好的耐受性[9，21，23]。最近有人推测ROS通过TGF-介导纤维化β端依赖途径(29，30.]。此外，ROS已经出现在dxr肾病的发病机制中[31，32]。有人认为DXR半醌在DXR肾毒性中起主要作用。虽然半醌类化合物的寿命较短，但它们会引发一系列反应，在与分子氧相互作用后产生ROS [5，33]。已经表明，DXR增加了自由基的产生，例如超氧化物，羟基自由基和过氧化氢，其具有脂质快速反应的能力并引起脂质氢过氧化物（LPO）[9]。LPO已知是DXR摄入的毒性表现之一;它的存在是通过测量MDA水平来确定的。据报道，dxr治疗小鼠的肾脏中存在过量的LPO [34]。在目前的研究中，与对照小鼠相比，DXR处理的小鼠表现出MDA的增加。GSH是最重要的含硫醇的抗氧化剂，它在预防氧化损伤时发挥着关键作用[35，36]。谷胱甘肽也被用作生物系统氧化应激的生物标志物[37]。在DXR小鼠中观察到谷胱甘肽的耗竭[34]。在我们的研究中，DAL降低了MDA的浓度并增加了GSH的水平。在组织微环境中回收氧化还原平衡是DAL施用肾的最可能机制，并抑制管状上皮 - 间充质转换。

Smad3是TGF-生物学效应的重要下游介质β，以及它们相关的家族成员调控着几百个基因的转录。在肾脏纤维化的背景下，Smad3在实验性和人类肾脏疾病中都被强烈激活[20.]。磷酸化的Smad3在DXR组中增加。由此可见，TGF-β/Smad信号通路在dxr肾病中被激活。然而，DAL可以逆转这一现象。I型胶原是一种成纤维基因，是TGF-的下游靶点β/ Smad3信号通路。DAL逆转了i型胶原的增加。此外，Smad7是TGF-的抑制剂β/Smad信号通路，在DAL处理下上调。DAL还可增加TGF-的mRNA和蛋白表达β在DXR-induced肾病。

综上所述，我们的结果表明，DAL在DXR小鼠模型中具有较强的肾保护作用。DAL的肾保护作用可能是通过抑制TGF-介导的β诱导的肾小管上皮-间充质转化。这是一项关于DAL肾保护作用的早期研究;具体的行动机制需要进一步澄清。

相互竞争的利益

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

昌良徐有项目的最初想法。湘托任，云博，君宁粉，而茂盛陈做了所有的实验工作。威洪赵在整个工作中提供了指导。Haowei He，西安仁，荣曲，玉莲金分析了实验数据。Daliang Xu和Yang Dong关于如何安排这些数字提出了一些建议。昌良徐起草了稿件。昌良徐和茂生陈提供资金。湘托任，云博，君泰粉丝，茂盛陈同等为这项工作进行了贡献，并将被认为是第一作者。

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no. 201430430429);基金资助:国家自然科学基金资助项目(81302829);2015 zz002)。

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