疾病特异性的自身抗体诱导Ra滑膜组织中的训练免疫力，其基因签名与对临床治疗的反应相关联

摘要

许多证据表明，在类风湿性关节炎（RA）的滑膜组织中，训练有素的免疫在滑膜组织中被疫苗，但潜在的机制仍然尚不清楚。在这里，我们描述了RA特异性自身抗体沉积物如何培训人单核细胞以施加多移炎症反应，特别是通过加剧释放肿瘤坏死因子的释放α.(肿瘤坏死因子α.)．通过平板结合人IgG (cIgG)或β-葡聚糖表明代谢向糖酵解转变是训练免疫的重要机制。此外，在ACPA- (anti - itrullinated protein antibody-)阳性关节痛和未分化关节炎患者的滑膜组织中，cigg训练的基因标记富集，早期RA和确定的RA与髓系病理类型非常相似，提示历史启动事件体内．此外，cigg训练的信号在女性、老年和acpa阳性人群中表达更高，在英夫利昔单抗的临床反应中具有预测作用。我们的结论是，ra特异性自身抗体可以早在无症状期就训练炎症损伤中的单核细胞，这不仅可以提高对疾病进展的了解，还可能为自身免疫性疾病的治疗和/或预防策略提供建议。

1.介绍

只有自适应免疫力可以建立免疫记忆的教条最近被训练有素的免疫或先天免疫记忆的新概念挑战了[1那2］．首先描述这种概念以接触到白色念珠菌或β-Glucans，它可以通过单核细胞的功能重新编程来保护宿主免受重生。机械地，该过程被定义为在不涉及永久性遗传变化的转录程序中持续重塑，例如基因突变，替代剪接或重组[2］．此外，在诱导训练的免疫期间存在促进糖酵解的代谢变化[3.］．一个体外实验培训的模型表明，这可能导致对病原体的次生刺激的反应性增加[4.，通过增强炎症介质的产生和消除感染的能力来证明。然而，训练免疫的不适当激活可通过其过度活跃引起一系列有害后果。有趣的是，越来越多的证据表明，这种亢进可能发生在疾病无症状阶段的早期事件，如高尿酸血症和高脂蛋白血症[5.那6.］．

类风湿性关节炎（RA）是最常见的自身免疫疾病之一，其特征在于滑膜炎症，导致软骨损伤和骨质破坏[7.］．早期识别炎症性关节炎的特征可以为避免不可逆转的关节损伤提供治疗窗口。重要的是，汇流中的加强滑膜巨噬细胞是早期RA的标志[8.那9.]，可能通过抗原呈递驱动T淋巴细胞浸润，进而触发B淋巴细胞膨胀和免疫球蛋白(Ig)等炎症介质的产生。通过组织病理学和转录组学相结合的方法，可以将RA中具有特定基因标记的滑膜组织分为三种主要的病理类型，即肌瘤型、髓样型和淋巴样型，这三种类型与它们的细胞组成相对应[10那11］．通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)识别浸润免疫细胞的特征，这些特征可以改善早期炎性关节炎患者的临床分类和治疗反应[10］．值得注意的是，有几条线索提示，训练免疫可能发生在炎症的滑膜病变下，导致无症状过渡到炎症性关节炎[5.那6.那12］．高活性RA患者分离的滑膜巨噬细胞也表现出高度活跃的炎症反应，产生大量的炎症细胞因子，以肿瘤坏死因子为代表α.(肿瘤坏死因子α.)[9.］．针对这些巨噬细胞产生的细胞因子的治疗已经被证明是成功的。此外，依那西普和阿达木单抗可下调启动子区组蛋白尾三甲基化和组蛋白3、4乙酰化CCL2（MCP-1）在单核细胞中，与RA中的疾病活动相关联13］．此外，上调Ra滑膜巨噬细胞的糖酵解，速率限制酶（例如丙酮酸激酶（PKM）和六酮酶（HK）），其作为增加的代谢活动的迹象[14那15］．然而，RA训练免疫的潜在机制尚不清楚。

最近，我们报道了IgG免疫复合物(ICs)的沉积可使人单核细胞对过度活跃的炎症反应敏感，并伴有转录组和表观遗传变化，这在临床RA中密切反映[16］．在滑膜中，大量的抗itrullinated蛋白抗体(ACPA)和类风湿因子(RF)与抗原形成ICs，导致它们的IgH链Fc片段受体(FcRs)的激活[17］．但是，由此产生的TNFα.水平相当低，表明Fc的边际容量γ.R（FC Gamma R）用于在没有任何促刺激的情况下刺激时诱导细胞因子产生。抗乳铁蛋白的动脉内自身抗体，与RA中的疾病活性相关，也表现出非凡的炎症反应体外[18］．有动力学自身抗体的炎症性能可以通过“双击”假设来解释，其诱导次级收费的受体（TLR）信号传导至FCγ.r从它们的抗原（例如，Vimentin，纤维蛋白原和乳铁蛋白）[18-20.］．此外，ACPA/RF双阳性的关节痛患者可迅速发展为RA，提示血清学反应是疾病进展的高风险[21］．因此，我们假设疾病特异性自身抗体可能诱导训练免疫，这可能反映在RA滑膜组织中。

在本研究中，使用一个可以诱导培训的免疫力的RA特异性自身抗体定义体外实验模型。产生了板结合的IgG-（CIGG-）培训的单核细胞的基因表达谱并与由训练免疫的范例进行比较β-Glucan并显示出糖酵解的显着富集，表明代谢转变是培训的免疫力的关键机制。此外，我们对GSEA评估了对来自ACPA阳性关节痛，未分化的关节炎，早期RA，成立的RA和骨关节炎以及健康捐赠者的患者的滑膜组织转录组的CIGG培训的基因签名。令人惊讶的是，这些CIGG训练有素的签名类似于髓样病理型的特征，并且与滑膜组织中的增强的免疫细胞浸润相关，这表明了历史初步事件体内．此外，cigg训练信号的表达具有性别、年龄和ACPA状态的偏倚，并在临床对英夫利昔单抗的反应中发挥预测作用。我们的结论是，ra特异性自身抗体可以早在无症状的自身免疫阶段训练炎症损伤中的单核细胞，这不仅可能提高对疾病进展的了解，也可能为自身免疫疾病的治疗和/或预防策略提供建议。

2。材料和方法

２.１.人血清中ACPA IgG和RF IgM的纯化

通过顺序亲和色谱法如前所述纯化ACPA IgG和RF IgM [22］．简单地说，我们收集了中国苏州大学第一附属医院风湿科30例ACPA和RF高滴度RA患者的ACPA和RF双阳性血清样本。亲和纯化前，用HiTrap Protein G柱(GE Healthcare)从血清中纯化IgG。用含1 M NaCl的12柱体积的磷酸盐缓冲液洗涤后，先进行预洗脱，分离RF-IgG相互作用，然后用0.2 M甘氨酸-盐酸(pH 2.7)洗脱，阻断蛋白G和IgG之间的高亲和作用。根据制造商的说明，合成CCP(环瓜氨酸肽)并将其偶联到溴化氰- (CNBr-)激活的Sepharose™4B (GE Healthcare)。将纯化后的IgG涂于CCP柱上，以1 ml/min的速度进行精练。结合抗体(Abs)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)广泛洗涤，用0.2 M甘氨酸- hcl (pH 2.7)洗脱，用1 M Tris-HCl (pH 8.0)中和。采用Amicon超离心过滤单元(Merck Millipore)超滤浓缩ACPA IgG。使用CaptureSelect™IgM亲和力矩阵(Thermo Scientific)，使用耗尽igg的RA血清池纯化IgM。RF IgM通过装载人IgG Sepharose™6B (GE Healthcare)获得。 The RF IgM fractions were collected and neutralized by adding 1 M Tris-HCl (pH 8.0) immediately after collection. The RF IgM was then concentrated using ultrafiltration. Both the ACPA IgG and RF IgM fractions were depleted of endotoxin by filtration through a polymyxin B column (Thermo Scientific). Lipopolysaccharide (LPS) levels were confirmed to be <0.058 ng/ml using a highly sensitive LPS enzyme-linked immunoassay (ELISA) kit (Cloud-Clone).

２.２.磁性分离单核细胞

使用Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich)离心分离健康献血者外周血单个核细胞(PBMCs)。根据制造商的说明，使用抗人cd14标记磁珠(Miltenyi Biotec)从pbmc中纯化人单核细胞。流式细胞术和显微镜观察结果显示，>95%的纯化单核细胞cd14阳性并存活。单核细胞在RPMI 1640培养基中添加10% ( ）来自相应捐献者的自体血清，并与青霉素/链霉素(100 U/ml)，在37°C, 5% CO₂．

2.3。在体外用RA自身抗体训练免疫模型

从6名不相关健康供体中新鲜纯化的人单核细胞与RPMI 1640培养基孵育在10 cm培养皿中，10μ.G / ml ACPA IgG，RF IgM或静脉注射Ig（IVG）（IgG）（Sinopharm）24小时。控制细胞单独或在LPS存在下用培养基培养（1 μ.g / ml）（大肠杆菌0111：B4，Sigma-Aldrich）（图1)．用0.25%胰酶(含0.9 mM EDTA (Invitrogen))分离细胞，用温PBS洗涤，96孔板传代 细胞/。静息后，分别用或不用RPMI 1640培养基和LPS (10 ng/ml)刺激细胞24 h。收集第一轮(灌注)和第二轮(刺激)上清，-20℃保存至测量。

细胞内染色, 单核细胞在10 cm培养皿中进行IgG包被(10μ.g/ml)刺激24 h，再用LPS (10 ng/ml)刺激2 h。使用细胞内染色试剂盒(eBioscience)进行染色，用allophycocyanin- (APC-)偶联的小鼠抗人TNFα.（Biolegend）或小鼠IgG1作为异型AB。冲洗后，通过流式细胞术评估荧光，并计算平均荧光强度（MFI）。

2.4。酶联免疫吸附试验

细胞因子和趋化因子的浓度用人TNF的商业ELISA试剂盒测定α.、白介素-6 (IL6)、CXCL8 (all, Invitrogen公司)和CCL2 (R&D Systems公司)。使用重组人细胞因子/趋化因子建立标准曲线;TNF检测灵敏度为4 pg/mlα.其中IL6为7.8 pg/ml, CXCL8为2 pg/ml, CCL2为10 pg/ml。

2．5．RNA序列

如前所述进行RNA测序[16］．简单地说，从细胞中提取细胞RNA，聚(A)富集，片段化，并转换成一个illumina兼容的测序模板库。由北京华大基因研究所(华大基因，中国武汉)在Illumina HiSeq 2000系统上进行单端测序。采用最大期望RNA测序(RSEM)对基因表达进行量化[23］．通过Empirical Bayes (EB) RNA测序方法(EBSeq)比较组间差异表达基因(DEGs) [24］．使用聚氨酯预防器进行京都基因和基因组（Kegg）富集分析次数[25］．这里报道的RNA测序数据已沉积到基因表达综合症中（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，加入号为GSE102728。

2.6。流式细胞术

对于细胞表型分析，收集单核细胞并用PBS洗涤，用Phycooerythrin-（PE-）共轭小鼠抗人CD14，CD16，CD209，CD40和CD80或APC，将颗粒在4℃下孵育30分钟- 缀合的小鼠抗人CD32，CD1B和CD86或荧光素异硫氰酸酯 - （FITC-）共硫氰酸酯 - （FITC-）缀合的小鼠抗人CD64或PE-，APC-和FITC-缀合的同种型控制ABS（Biolegend）。洗涤后，使用BD FacScanto TM II流式细胞仪（BD Biosciences）分析细胞。

2.7。转录组织的翻译组织队列

从基因表达Omnibus检索滑膜活检队列的转录组（登录号GSE89408）。通过Geo RNA-SEQ实验互动导航仪（GREIN）加工并量化原始的RNA测序数据[26];临床资料来自先前的一项研究[27]，列于附表1．简单地说，健康的捐赠者和骨关节炎患者是从一组膝盖疼痛的患者中被识别出来的，他们参加了在手术设施的运动医学日，这是由关节炎或临床史的证据区分的。关节痛患者指的是基于其症状的人群，而不是特定的诊断，而未分化关节炎定义为滑膜炎的临床症状和不符合2010年美国风湿病学会RA标准的患者。早期RA指首次评估12个月内treatment-naïve RA;已建立的RA指>12个月病程的经治疗的RA。机构伦理审查委员会批准了收集滑膜活检的所有方案。所有患者都签署了参与研究的同意书。

2.8。基因集富集分析

Hallmark Gene Sets（ ）在分子签名数据库（MSIGDB）中[28的转录组比较分析β-葡聚糖培养的单核细胞(登录号GSE58310) [2]，使用GSEA进行[29］．通过CIGG培训的单核细胞的RNA测序从DEGS中的前100个上调基因定义CIGG基因签名。此外，描述了包括CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，树突状细胞，CD19 + B细胞，T调节剂（Treg）细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，CD34 +祖细胞，Synovibie和成纤维细胞和成纤维细胞的基因组如前所述[30.，基于哺乳动物基因组功能注释(FANTOM5)项目的cap分析基因表达(CAGE)数据[31］．另外，基于具有LPS和干扰素γ的经典活化（M1）的体外刺激的单核细胞的基因表达来定义M1巨噬细胞基因特征。（IFNγ.）与IL4的替代激活（M2）[32］．密歇根RA队列研究定义了髓样、淋巴样和纤维瘤表型的病理特异性基因集[11］．补充表2列出基因集合的信息。

2.9。统计分析

使用棱镜软件（GraphPad）进行所有统计分析。由于样品的正常分布不能假设，Kruskal-Wallis测试随后通过DUNN的多个比较试验后的HOC测试用于> 2组，以及双尾曼诺测试用于两组未配对样本。一种值< 0.05认为有统计学意义。

2.10。研究批准

苏蒙大学伦理委员会批准了这项研究。该方法是根据潜监机构大学的指导进行的。在将研究中纳入之前，从所有参与者获得书面知情同意书。

结果

3.1。ACPA IGG沉积物诱导人单核细胞中的训练疫苗

为了验证我们的假设，即存在ra特异性自身抗体可以训练先天免疫，我们纯化了ACPA IgG，并基于之前的研究使用体外模型研究训练免疫的能力[4.)(图1)．由于ACPA IgG的存在可能形成针对瓜氨酸蛋白的ICs，平板结合的RA自身抗体被用来模拟体内FcR的复杂交联。从6名不相关的健康供体中新鲜纯化的单核细胞与cACPA IgG在培养皿中孵育24小时，然后在第一轮培养上清中定量细胞因子和化能因子。有趣的是，cACPA IgG中TNF含量有限α.和IL6生产<200 pg / ml（图2（a）和2(b))。相反，LPS激发强烈刺激单核细胞以TNF形式释放促炎细胞因子α.和白细胞介素6。此外，平板结合的RA自身抗体刺激单核细胞释放大量趋化因子，包括CXCL8和CCL2(图)2(c)和2（d）），其可以提供趋化信号，以便在发炎的病变中渗透骨髓谱系细胞[33］．值得注意的是，在cACPA IgG、cRF IgM或cIgG启动单核细胞时，炎症介质的释放没有显著差异。

然后，用0.25％胰蛋白酶-EDTA脱离细胞，并用温热的PBS洗涤以除去先前的暴露。通过精确的细胞计数，将丙施电池转化为96孔板，而无需额外处理。再次24小时后，用10ng / ml LPS刺激细胞（图1)．正如预期的那样，LPS诱导单核细胞产生内毒素耐受表型，表现为细胞因子和趋化因子的释放减弱(图)2（e） -2(h))。尖锐的是，与对照（Mo（对照））和CRF IgM-灌注单核细胞（MO（CRF / IGM））根据LPS刺激后释放的细胞因子或趋化因子的量（图2（e） -2(h))。Mo(cACPA/IgG)和Mo(cIgG)之间的一致性表明，IgG同型抗体触发了训练信号，而不是IgM。重要的是，将已启动的细胞暴露于RPMI 1640培养基中并没有诱导大量的炎症介质，这可能排除了细胞因子释放的累积效应。此外，TNF的增加α.(约10倍)比其他细胞因子或趋化因子(2- 4倍)高得多(cACPA/IgG)和Mo(对照)。此外，我们对TNF进行了细胞内染色α.钼（CIGG）的合成。值得注意的是，TNF.α.与MO（CONTROL）相比，LPS刺激后LPS刺激后的荧光强度急剧增加（图）（图）2(我),2（j））。这些发现表明，滑膜组织中的IgG自身抗体沉积物可能诱导体内训练的免疫力，这可能会增加炎症细胞因子释放并有助于Ra的发病机制。

3.2。CIGG培训的单核细胞的基因表达谱

我们对CIGG培训的单核细胞进行了转录组分析，以检查RA自身抗体训练的免疫的基因表达谱。简而言之，根据体外训练模型处理来自三种健康供体的新分级单核细胞（图3（a）)．24小时灌注后，提取细胞RNA并进行高通量RNA测序以进行转录组分析。EBSEQ包（V 3.10）[24结果显示，Mo(cIgG)与Mo(对照)共存在725个DEGs，其中375个表达上调，350个表达下调(图)3（b）)．进行DEGS的Kegg富集分析以确定MO（CIGG）的特征，并显示富含细胞因子 - 细胞因子受体相互作用，与细胞因子，RA和MAPK信号通路，趋化因子信号通路的病毒蛋白相互作用，细胞粘附分子（凸轮），可收费的受体信号传导途径，RAP1信号通路和FCγ.R-mediated吞噬作用(图3（c）)．

数字3（d）显示了Mo(cIgG)基因的强烈上调或下调。与功能研究结果一致，Mo(cIgG)的趋化因子(如CCL2、CCL22、CCL4和IL8)、集落刺激因子(如CSF1)和细胞分子共刺激(如CD1B、CD40和CD209)的基因表达增加，而Fc的表达减少γ.R III (CD16)， CD14和HLA-DR。此外，Mo(cIgG)上调了促进RA破骨细胞发生和骨吸收的细胞因子基因TNFSF14 (LIGHT)和SPP1 (osteopontin) [34那35］．流式细胞术证实了CD40，CD1b和CD209表达增加和CD16和CD14表达的增加（图3 (e))．这些独特的特征可以提供检查RA Auto istibodies训练的免疫的分子机制的机会。

3.3。比较转录组分析CIGG-和β-Glucan-Trained免疫力

由于在cIgG-和之间观察到的训练特征有很高的相似性β-Glucan-灌注单核细胞，我们想知道培训过程的核心监管机制。因此，我们在CIGG-和CIGG-和HARCE之间进行了比较转录组分析β-葡聚糖训练的单核细胞使用GSEA标记基因集收集( )．令人惊讶的是，共有5个基因集:糖酵解、胆固醇稳态、MYC-targets_V1、MYC-targets_V2和MTORC1_signaling(见图)4（a）)．众所周知，玻璃醇的细胞代谢转变是一种关键机制β- 葡萄酒训练的单核细胞，以前的研究已经广泛展示[2那29］．相对于Mo（对照），包括HK3，磷光葡萄糖异构酶（GPI），磷化氢氨基酶（PFKP），醇酶（ALDOA），甘油酶（AldoA），甘油酶（AldoA），甘油酶（AldoA），甘油醛-3-磷酸脱氢酶，在Mo（CIGG）中升高了几种速率限制糖糖酶（GAPDH），磷酸性激酶（PGK1），磷酸性蛋白酶（PGAM1），烯醇酶（ENO）和PKM（图4 (b)和4 (c))．这些研究结果表明代谢转变对培训和维护的血糖溶解的作用。

3．4．cigg训练的信号在RA滑膜组织中富集

虽然已对训练免疫的分子机制进行了深入研究[2那3.那36]，但其在体内的作用仍很大程度上未知。最近的研究(10那11那30.]已经根据三种主要的组织学病理类型描述了滑膜组织中存在的组织异质性:纤维瘤、髓样和淋巴样。纤维样病理类型提示成纤维细胞缺乏免疫病理类型，髓样病理类型提示髓系为主但B细胞/浆细胞缺乏，淋巴样病理类型主要是淋巴系浸润(T细胞、B细胞和浆细胞)以及髓样细胞[10］．因此，要深入了解受组织异质性的训练的免疫力，我们通过RNA测序定义了MO（CIGG）中的前100个上调基因作为CIGG培训的签名（图3（a）和补充表2)，并在GSEA中对滑膜组织进行了三种病理类型标记[27]从健康人士( ）以及患有骨关节炎( ），ACPA阳性关节痛（ ），未分化的关节炎（ ），早期类风湿性关节炎( ），并建立ra（ ）（数字5(一个))．我们还使用其特定基因签名分析了13种类型的免疫细胞和组织驻留细胞群（补充表2)．

与健康的滑膜活组织检查相比，CIGG培训的签名在来自关节痛和未分化的关节炎的RA的临床前阶段富集至早期RA，但不在骨关节炎（图5 (b))．值得注意的是，目前队列中的关节痛患者对ACPA和RF具有双阳性，并且迅速发展RA的高风险[21］．同样，从未分化关节炎到早期类风湿性关节炎的滑膜组织也存在髓样评分，但关节痛的滑膜组织没有髓样评分(图)5 (c))．有趣的是，骨关节炎患者髓系评分的轻微增加表明髓系细胞也可能在骨关节炎中发挥作用。相反，在早期RA (naïve治疗)和确诊的RA(图)中淋巴特征选择性富集5 (d))，这与深度炎症反应和淋巴细胞增殖的观察相一致。令人惊讶的是，在疾病组中肌瘤评分的急剧下降表明它是一个潜在的健康生物标志物(图)5 (e))．更重要的是，这种差异也依赖性和年龄依赖性，这表明妇女和老年人对开发RA的风险很高（数字5 (f)和5 (g))．此外，在acpa阳性人群中，cigg训练的评分显示出更高的富集度，而在髓样和肌瘤类型之间没有显著差异(图)5 (h))．

在滑膜病变中，浸润的免疫细胞与谱系特异性病理类型高度相关，与肌瘤病理类型呈负相关(图)6(一))．重要的是，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞富集与淋巴和髓样病理有关的差异，表明这些细胞群可能通过抗原呈递细胞（APC）连接，导致淋巴细胞和中性粒细胞浸润和活化。尖锐的是，中性粒细胞与CIGG培训的巨噬细胞强烈相关（Pearson 那 ）与m1不那么相关（Pearson 那 ）和M2巨噬细胞(Pearson 那 ）（数字6 (b))．CIGG培训的巨噬细胞也用嗜碱性粒细胞强烈相关（Pearson 那 ）和嗜酸性粒细胞（皮尔逊 那 )．训练有素的细胞因子和趋化因子产生可能有助于对发炎的利基招生更多的炎症作用，导致炎症反应扩增，从而产生促进炎症的炎症的恶性循环。CIGG培训的巨噬细胞也与CD34 +祖细胞有关（Pearson 那 ）（数字6 (b))，这涉及到一个过早衰老的过程[37]，包括在免疫系统的成形中的早期事件。

3.5。CIGG培训的签名可以预测RA中的生物治疗益处

增加肿瘤坏死因子α.生产是训练免疫的主要特征，并已被证明是最有效的治疗目标。因此，我们假设这些训练信号可能与抗tnf的临床反应有关α.治疗。因此，我们使用独立的Ra滑膜基因表达队列（GSE21537）[38以验证用于预测英夫利昔单抗抗TNF的临床反应的基线cigg训练信号α.主要由滑膜巨噬细胞产生。患者根据疾病缓解程度对英夫利昔单抗的欧洲抗风湿病(EULAR)临床反应进行分组，并在16周时由DAS28(疾病活动评分，包括28个关节计数)监测。值得注意的是，基线cigg训练特征表达在良好( 那数字7(一))或中度欧拉免疫反应( 那数字7(一)）与穷人的响应者相比。在临床治疗反应之间观察到髓样之间的类似相关性（图7 (b))．然而，淋巴和肌瘤评分，尽管也标记炎症过程，但与临床结果无关(图)7 (c)和7 (d))．数据表明，cigg训练信号可用于预测抗tnf的临床治疗反应α.治疗。

4。讨论

先天免疫训练最初是通过接触C.老年人或β-Glucan具有宿主保护，用于重新感染，而受过训练的免疫的不恰当的激活可能会导致有害影响，特别是在炎症和自身炎症疾病中的影响[1那2那5.那6.］．在目前的研究中，我们描述了如何使用ra特异性自身抗体训练人类单核细胞以显示增加的反应性(图)2（e） -2(h))，这加强了自身抗体训练的免疫在RA发病机制中的重要性。我们的结果表明，抗ACPA(主要是IgG1)和RF(主要是IgM)抗体的沉积具有不同的训练性质，这主要是由于其同型及其功能。一般来说，RF IgM和ACPA IgG是RA中最显著的两种自身抗体，在疾病症状出现前几年就存在，临床信息不同[39那40］．RF水平的波动被认为是疾病活动和治疗反应的炎症标志物。从病理角度看，IgG可通过Fc激活巨噬细胞γ.r参与，而IgM可以诱导补充激活[41］．在这里，我们观察到ACPA IgG训练的能力，它反映了不同的功能RF IgM(图)2（e） -2(h))。最近的一项研究表明ACPA IgG可触发RF IgM对TNF的放大作用α.人体单核细胞的生产[42］．这也与之前的研究结果一致，即ACPA IgG阳性的RA患者疾病活动较轻，而ACPA IgG和RF IgM双阳性的患者急性期反应物升高[43那44］．与RF IgM相比，ACPA IgG在与RA中的射线照相损伤的严重程度的关系方面似乎较少。19那45］．值得注意的是，在细胞因子的产生方面，cigg训练的单核细胞相对静止。然而，cigg训练的单核细胞在这个过程中可以产生趋化因子，这可能为白细胞和髓系细胞提供强大的趋化信号(图)2(g)和2(h))。同时，CSF1和核因子受体激活因子-上调κβ.在CIGG培训的免疫力中也可以看到配体（RANKL）信号传导（图3（d）），其可能诱导疏口细胞源性分化，促进软骨损伤和骨破坏[46］．

在滑膜组织中的自身筛选的广泛筛选揭示了IC的丰富沉积[17]这表明使用CIGG用于模仿ICS是病理物理学相关的。在这里，我们比较了培训的人单核细胞的转录组β-葡聚糖和经过cIgG训练的基因，识别出5条核心调控途径，分别代表糖酵解和mTOR信号通路(图)4（a）)．这可能表明通过靶向培训的免疫的特定机制，例如糖酵解和MTOR信号通路等特定机制来提出自身免疫疾病的新治疗和预防策略。此外，RA滑膜巨噬细胞之间存在许多相似之处和训练有素的免疫力。例如，Ciurtin等人。使用质子磁共振光谱（MRS）并报告的乳酸升高和葡萄糖浓度下降，在滑液中提出了Synovia的糖酵解活性增加[47］．在本研究中，在cigg训练的单核细胞中，几种限速糖酵解酶(如HK3、PFKP、ENO和PKM2)上调，这在RA炎症巨噬细胞中也得到了证实[14那15］．此外,Akt-mTOR-HIF1α.需氧糖酵解的信号通路依赖诱导是训练免疫的代谢基础[3.］．mTOR的抑制减少了滑膜破骨细胞的形成，保护了局部骨侵蚀和软骨丧失[48］．此外，表观遗传修饰也似乎是训练有素的免疫力的关键机制[2］．有趣的是，我们最近的研究[16在cigg训练的单核细胞中，通过H3K4三甲基化在各种炎症细胞因子上定义了显著的组蛋白修饰，这提供了一种不发生遗传改变的持久能力的表观遗传记忆。使用TNF治疗α.抑制剂（依那西普和Adalimumab）可以在单核细胞中的CCL2（MCP-1）的启动子位点下调H3K4，H3K27，H3K36和H3K79三甲基化，其与RA疾病活性相关[13］．因此，训练免疫的意义可能通过靶向训练免疫的分子机制，包括免疫学和代谢到表观遗传方法，为RA提供新的治疗和预防策略。

越来越多的人认识到滑膜组织作为RA的主要病理部位的重要性，它比外周血对疾病的信息更丰富。此外，GSEA可以确定特定基因集的丰度，并被广泛用于研究组织中的免疫细胞浸润。为了进一步确定cigg训练的免疫在滑膜组织中的作用，我们使用前100位cigg训练的单核细胞中上调的deg对滑膜组织的转录组数据集进行GSEA。在关节痛、未分化关节炎、早期RA和已建立RA患者的滑膜组织中，cIgG信号强烈富集，提示历史启动事件(图)5(一个)和5 (b))．值得注意的是，纳入我们队列的关节痛患者在第一次临床评估时ACPA和RF血清学呈阳性，且快速发展为RA的风险较高(补充表)1)[21］．因此，我们的发现表明培训的免疫力可能在早期阶段充当关键炎症事件，这与慢性炎症性疾病的研究结果类似，例如高尿血症和动脉粥样硬化[5.那6.］．值得注意的是，临床参数与cigg训练信号的比较表明，RA的高危因素是女性、老年和ACPA+状态(图)5 (f)-5 (h))，这与流行病学研究的结果一致。

最近的研究(10那11那30.]已经描述了滑膜组织中存在的组织异质性，表现为三种主要的组织学病理类型:纤维瘤、髓样和淋巴样。重要的是，浸润的髓系细胞是早期类风湿性关节炎发病机制的关键驱动因素[10那11］．为了阐明训练免疫在体内的作用，将cIgG训练的基因标记与三种病理类型进行比较，发现与髓系病理类型的相似性高于与M1或M2巨噬细胞的相似性。在健康组织中，肌瘤的病理类型明显丰富(图)6(一)），表明确定的内型但不是终级疾病特征。然而，淋巴局部型与疾病活性，急性相反应物和疾病改性的抗触发药物（DMARD）反应强烈相关[10］．此外，我们构建了渗透的免疫细胞的相关矩阵（图6.)．引人注目的是，cIgG训练与浸润的白细胞(表现为中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和CD34+祖细胞)密切相关，这表明训练免疫在转移免疫细胞浸润中具有潜在作用。此外，在良好或中度EULAR反应的患者中，cigg训练信号的基线显著增加(图)7(一)）与穷人的响应者相比。数据表明，CIGG培训的签名可用于预测对抗TNF的临床响应α.治疗。

5.结论

我们的结果表明RA特异性自身抗体可以在发炎病变中诱发训练的免疫力，表明致病过程中的历史初步事件。此外，在滑膜组织中的CIGG培训的签名表达在对临床治疗的反应中发挥了预测性作用。因此，我们的研究不仅可以推进对RA发病机制的理解，但也可能表明自身免疫疾病的新型治疗和/或预防策略。

数据可用性

支持查找本研究的数据可根据相应作者提供。

利益冲突

作者声明本工作没有利益冲突。

作者的贡献

QZ和X-MG设计了研究。XLD，XQD，GZ，CY和KQZ进行了实验。QZ和G-FY分析了数据。QZ和X-MG准备了稿件。所有作者讨论了对稿件的结果和评论。

致谢

国家自然科学基金资助项目(no . 31570868/81971995);江苏省自然科学基金资助项目(no . BK20191179);苏州市青年科教医师基金资助项目(no . KJXW2017025)。关键词:生物力学，力学特性，力学特性，数值模型，数值模型

补充材料

补充表1：患者的信息。补充表2：本研究中使用的基因列表。（补充材料）

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