瘦素促进了IL-17在过敏性鼻炎中的ILC2产生的产生

抽象的

背景。白细胞介素-17在过敏性疾病中起重要作用。有几项研究证明，瘦素通过诱导ROR促进TH17免疫反应γ.T转录。ILC2是免疫应答早期阶段的重要成员。因此，我们的目标是探讨瘦素在本研究中的ILC2在ILC2中的IL-17生产的影响。方法。15岁患者和十五种健康对照。测量血清瘦素水平，并使用酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术分析它们与IL-17 + ILC2细胞频率的相关性。通过瘦素刺激ILC2，ELISA检测IL-17，IL-5和IL-13的表达。通过实时PCR确认相关途径。结果。与对照组相比，我们发现血清瘦素和Al-17产生ILC2S的IL-17产生的频率显着高。与瘦素孵育后，与对照相比，将IL-17 + ILC2细胞和IL-17产生的IL-17产生的频率上调。我们还发现瘦素引起的RORγ.ILC2的T和AHR表达。此外，瘦蛋白诱导的IL-17产生ILC2伴随着表达IL-5和IL-13。结论。我们的数据提供了初步证据，即瘦素诱导的ILC2细胞的IL-17生产取决于RORγ.t和Ahr的表达和瘦素的阻断可能是治疗急性变应性鼻炎的一个有希望的靶点。

1.介绍

流行病学研究表明，全世界过敏性鼻炎（AR）的影响超过5亿人，特别是儿童[1］．近年来，中国的AR的发病率也显着增加了[2］．

白细胞介素-17主要从Th17细胞分泌，在过敏性疾病中起重要作用。例如，IL-17在肺部，痰和支气管肺泡灌洗液（BALF）中发现了哮喘患者的[3.那4.］．此外，IL-17的水平与AR的严重程度相关[4.］．以前的研究还表明外源性抗IL-17和抗IL-23抗体可以缓解卵磷蛋白诱导的AR小鼠中的症状，TH2反应和血清IgE水平[5.-7.］．

ILC2广泛分布于脂肪相关的淋巴组织，肠，肺和皮肤中，是免疫应答早期的重要成员。最近的研究表明，ILC2S可以产生IL-17并表达较高水平的视黄酸 - 受体相关孤儿受体 -γ.T（ROR.γ.t），调节各种免疫细胞中的IL-17转录[8.那9.］．

Leptin是由肥胖（OB）基因编码的16kDa尼替糖基化多肽，其调节能量稳态，神经内分泌功能，血管生成，血液缺陷和T细胞活化和功能[10］．有几项研究证明，瘦素通过诱导ROR促进TH17免疫反应γ.Tstemic狼疮红斑狼疮和关节炎的转录[11那12］．我们以前的数据提供了证据表明，瘦素的上调促进了AR中的ILC2反应，并且通过PI3K / AKT途径实现了该过程的[13］．因此，我们的目标是探讨瘦素在本研究中的ILC2在ILC2中的IL-17生产的影响。

2.方法

2.1。耐心

十五岁患者在2019年1月至2019年6月在广州妇女和儿童医疗中心招生了尘埃螨和十五次健康控制的患者。AR是根据过敏性鼻炎和对哮喘指南的影响（2010）定义的。标准包括典型的症状和持续时间（> 2年），阳性过敏原测试DermatophagoğdesPteronyssinus.和Dermatophagoides farinae皮肤点刺试验( ），和特异性的IgE测量（> 0.35 kiu / L，Phadia，乌普萨拉，瑞典）[1］．患有特应性皮炎，哮喘和其他鼻疾病的患者，并且在前1个月内使用过全身和鼻皮质类固醇的患者被排除在外。所有研究受试者都有正常的BMI。研究协议被当地伦理委员会委员会批准，并获得了书面知情同意书（第20691号）。

2.2。ILC2的流式细胞仪

使用淋巴溢（Fresenius Kabi Norge As，Oslo，挪威）密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMC）。PMA（50ng / ml，Sigma-Aldrich），离子霉素（500ng / ml，Sigma-Aldrich）和Brefeldin A（BD，牛津，英国）用于治疗4小时。IL-25（50ng / ml），IL-33（50ng / ml），TSLP（50ng / ml）和IL-2（10U / mL）（R＆D Systems，USA）也被添加用于ILC2刺激。然后，用谱系标记染色PBMC（CD2（RPA-2,10），CD3（OKT3），CD14（61d3），CD16（CB16），CD19（HIB19），CD56（TULY56）和CD235A（HIR2），eBioscience那San Diego, CA), FceRI (9E1, eBioscience) and CD45 antibodies (2D1), CRTH2 (BM16, BD Biosciences, NJ), and CD127 antibody (HIL-7R-M21, BD Biosciences, NJ) for identification of ILC2s. IL-5 (JES1-39D10)-, IL-13 (JES10-5A2)-, and IL-17A (BL168)-positive ILC2 cells in PBMCs were determined by intracellular cytokine staining using Cytofix (BD Biosciences, NJ) as described by the manufacturer’s instructions. The Beckman flow cytometer machine was used in the test (Beckman Coulter, Hercules, CA, USA).

2.3。ILC2排序

耗尽血管阳性（林⁺）通过荧光素的细胞异硫氰酸酯 - （FITC-）CD2，CD3，CD14，CD16，CD19，CD56，CD235a和Fc的缀合抗体ε.RI，谱系 - 负（林^-）从AR患者的PBMC获得细胞。然后，丰富的林^-使用Phycooerythrin-（PE-）缀合的CRTH2和Hycooerythrin-Cy7-缀合的CD127（BD Biosciences，NJ）染色细胞。林^-Crth2.⁺CD127⁺细胞 （ 根据说明书，通过纯度（Bd Biosciences，NJ）将细胞/ ml分选，纯度超过95％。分类的细胞（ ）在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养液中培养7天，细胞因子组合(CC): IL-25 (50 ng/ml)、IL-33 (50 ng/ml)、TSLP (50 ng/ml)和IL-2 (10 U/ml) (R&D Systems, USA)。刺激实验:CC、CC+leptin (100 ng/ml)、CC+leptin (100 ng/ml)+RORγ.在不同组中加入T抑制剂（100ng / ml）和CC +瘦蛋白（100ng / ml）+ AHR抑制剂（100ng / ml）（R＆D Systems，USA），以72小时的刺激。

2.4。定量实时PCR（QRT-PCR）

用TRIzol试剂(Life Technologies, Carlsbad, California)从ILC2s中分离总RNA。用cDNA试剂盒(Qiagen)合成cDNA。采用ABI PRISM 7300检测系统进行PCR扩增。结果归一化为GAPDH。本研究使用的引物如下:RORγ.T forward 5. -CCG CTG AGA GGG CTT CAC-3和反向5. -TGC AGG AGT AGG CCA CAT TAC A-3 ;AHR前进5. -tccttggctgaactcaagctgt-3和反向5. -GCTGTGGACAATTGAAAGGCACGA-3 ;和GAPDH前进5 -AGCCACATCGCTCAGACAC-3和反向5. -GCCCAATACGACCAAATCC-3 。

2.5。酶联免疫吸附试验（ELISA）

采用制造商所述的ELISA试剂盒(R&D Systems, USA)测量ILC2上清中IL-17的水平。leptin (22 pg/ml)和IL-17 (15 pg/ml)测定的敏感性分别为:leptin (22 pg/ml)和IL-17 (15 pg/ml)。

2.6。统计分析

使用GraphPad Prism软件。用Kruskal-Wallis测定统计学意义测试或曼恩惠特尼测试。Spearman等级相关分析完成。一种值小于0.05被定义为显着差异。

结果

3.1。血清瘦素和IL-17产生ILC2s在AR中的相关性

研究对象的特征如表所示1。AR和对照组之间的患者具有可比年龄，性别比和年龄。我们发现，与对照相比，AR中的IL-17产生ILC2S的频率显着更高（ ）（图1（b）和1（d））.与对照相比，AR患者瘦素的蛋白表达显着上调（ ）（数字1（c））.血清瘦素蛋白表达与AR患者的IL-17产生ILC2S的频率呈正相关（ 那 ）（数字1（e））.

3.2。瘦素产生IL-17的ILC2S的诱导取决于RORγ.t和ahr.

当仅在分选细胞中加入PBS时，AR患者产生il -17的ILC2s的频率几乎无法检测到。CC (IL-25 (50 ng/ml)、IL-33 (50 ng/ml)、TSLP (50 ng/ml)和IL-2 (10 U/ml)的添加增加了产生il -17的ILC2s的频率。此外，与CC相比，瘦素与CC的结合进一步增加了il -17产生ILC2s的频率(图)2（a）和2（b））.

与瘦素刺激后的对照相比，IL-17在ILC2的培养上清液中产生的产生（图2（c））.但是，添加了两个rorγ.T抑制剂和AHR抑制剂减少了瘦素显着诱导的IL-17产生（图2（c））.我们一致观察到瘦素诱导RORγ.ILC2的T和AHR表达（图2（d）和2（e））.为了确认产生IL-17的ILC2具有相同的传统ILC2特征（IL-5和IL-13的产生），我们通过IL-17产生ILC 2测量IL-5和IL-13表达。我们的结果表明，瘦素诱导的IL-17产生ILC2伴随着IL-5和IL-13（图3.）.

4。讨论

在本研究中，我们发现瘦素诱导ILC2细胞产生IL-17依赖于RORγ.T和AHR表达。我们的研究提供了IL-17规定的新途径。

由脂肪组织产生的瘦素在免疫中起重要作用[10那14］．在适应性免疫中，瘦素已被证实在人类和小鼠的Th1、Th2和Th17反应中发挥作用[15-17］．例如，Zheng等的研究发现，瘦素并没有改变Th2细胞在体内和体外的分化，而是促进了Th2细胞的存活和增殖，表现为IL-4、IL-5、IL-13的表达增加[18］．对于先天免疫力，我们以前的数据表明，瘦素也参与了AR中的ILC2调节，通过PI3K / AKT途径实现了该过程[13］．始终如一地，郑等人。的研究表明，哮喘模型的OB / - 和野生型对照小鼠之间的ILC2s的总数减少但相当的频率。

ILC2的扩增和发育需要IL-2、TSLP、IL-25、IL-33等细胞因子。IL-25促进炎性ILC2增殖(Lin⁻IL-17RB.^高的klrg1.^高的ST2.⁻）在肺中，而IL-33诱导天然ILC2S（林^-IL-17RB.^低的klrg1.^㈡ST2.⁺) [19-21］．先前的研究证实，天然ILC2S产生少量IL-17，但炎症ILC2S可以表达高水平的IL-17 [19-21］．炎症ILC2S也表达RORγ.t，它是各种类型免疫细胞中IL-17表达的主调节因子[22-24］．

我们的数据表明，瘦素增强的IL-17 + ILC2细胞膨胀和IL-17生产。此外，这个过程取决于ROR的表达γ.T和AHR，因为当ROR时，IL-17表达显着抑制γ.加入t和Ahr抑制剂。Ahr是Th17细胞因子表达的另一调节因子，其受体(Ahr)在Th17细胞中高度表达[25］．

以前的研究还建议AHR在ILC的调节中起重要作用。例如，肝脏驻地ILC1维护和ILC3维护和功能需要AHR [26那27］．抑制AHR表达促进肠道中的抗骨火免疫力，而AHR的激活抑制ILC2功能，但增强ILC3函数保护主体枸橼酸杆菌属rodentium感染(28］．这些结果表明，AHR途径涉及ILC2-ILC3平衡以将适当的免疫力用于各种病原体。始终如一地，我们的数据表明，瘦素通过AHR途径通过ILC2调节IL-17生产。

与之前的研究一致，我们的研究结果还表明，leptin诱导的ILC2s同时产生IL-5和IL-13，这与记忆/效应细胞IL-17+Th2相似。这些数据提示瘦素诱导的ILC2同时具有ILC2和Th17细胞的特征。

我们的研究也有一些局限性。首先，我们通过瘦素刺激血液ILC2。但瘦素对局部ILC2（例如肺和鼻组织）的影响没有探索。其次，本研究未使用动物模型，这也限制了我们的结论。第三，没有探索瘦素诱导的ILC2和Th17细胞之间的相互作用。

总之，我们的数据提供了初步证据，表明瘦素诱导ILC2细胞产生IL-17依赖于RORγ.t和Ahr的表达和瘦素的阻断可能是治疗急性变应性鼻炎的一个有希望的靶点。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

伦理批准

研究协议被当地伦理委员会批准。

同意

获得了书面知情同意书。

利益冲突

作者宣布他们没有相关的利益冲突。

作者的贡献

延辉文，清乡曾和十一罗同样贡献了这项工作。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学补助金的补助金（No.81600785，No.81700892和No.11970861号），广州珠江S和T Nova计划（201710010085号），关键临床专业Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Grant of Institute of Pediatrics of Guangzhou Women and Children’s Medical Center (YIP-2016-022 and Pre-NSFC-2018-005), the Dongguan Social Science and Technology Development (Key) Project (201950715024194), and the Guangdong Province Natural Science Grant (No. 2016A03031016).

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