抽象性

目标.慢性阻塞性肺病是一种常见慢性病,并迅速发展成世界范围严重的公共健康问题。何谓CCD事件基本不明尝试探索p16高表达式p300/Sp1能否通过推广内生细胞的异性引起慢性阻塞性肺病方法论.外围血迹EPC与非吸食非COPD、吸食非COPD和吸食CPD病人隔离表达式p16p300和evenence相关基因由RT-PCR和WesternBlot检测并用CK8检测细胞扩散、流细胞测量检测细胞循环辰族galactosidase染色计数分数结果.p16高表达式发现于PCD患者外围血液EPCs烟抽出p16P16高表达式EPCs推广细胞循环抓捕CSE中间高表达器p16推广细胞守默P300表达式在PCD患者外围血液EPC中增加P300/Sp1还提升p16推广者区exoneH4剖析水平,从而调节EPCs的异义性击倒p300/Sp1可营救CSE居中守结论.P300/Sp1提高p16推广者区域前台H4直方位

开工导 言

慢性阻塞性肺病是一种常见慢性病,其流行率、残疾率、死亡率和社会负担逐年增加,演变成严重的公共健康问题目前,人们普遍认为吸烟是诱发COPD的主要原因,而其发病尚不完全解析CCD被视为一种过早肺衰竭[一号-4..EPC是内代细胞的前导细胞,与Mesoderm动脉分离并参与人类胚胎动脉生成5,6..分治异性细胞和生物特征,如分治活性物质、扩散、寻名和迁移,异性子细胞(EPCs)在产后造影、再分解化、组织再生和修复中发挥着非常重要的作用7-九九..

p16基因归INK4基因组所有,由四大成员组成:p16INK4A,p15INK4B,p18INK4C和p19INK4D都具有细胞生长抑制和肿瘤抑制等生物特征10..p16也是紧接p53后第二常用肿瘤抑制基因被广泛认为家庭黑素基因,其免疫史化学在某些病理条件中作用清晰11..并发现p16在细胞守默中起关键作用细胞敏捷性是细胞生长的不可逆块生物化学和形态变化发生于细胞常识期间,包括形成独有细胞形态学,如平面细胞形学[12..细胞抗争不可逆转地阻塞细胞生长并伴生化和形态变化,其中包括形成单细胞形态学,如单细胞形法13..p16中介eceence导致chromatin重组,这与抑制受转录因子E2F1调控的基因相关13,14..Chromatin重新编译Occogene诱发的早阳性特征为SAHF(与 serescense相联异色素损耗),表现为稠密核脱氧核和集中H3K9三甲基化15,16..

研究报告EPC子量下降和功能下降与CCD患者外围血量下降高度关联17..寄生动物模型中骨髓EPC扩散、分解和粘合下降,骨髓EPC表达式16(INK4a)增加,而干细胞抗原1(sca-1)和cKit表达式下降[18号万事通烟雾提取器可直接诱导体外培养式EPC机能失灵和上述基因表达层次变化说明EPC渐渐耗竭18号-20码..鼠标模型通过气管用异质正常EPC进一步移植,结果显示,EPC移植后,不仅肺功能和肺部病理变化得到显著提高,支气管溶液流体矩阵金属蛋白素水平和活性提高20码-24码..EPCs极有前景的血管健康生物标志应用广度,可用于治疗一系列临床疾病[25码..先前的研究显示,EPC在COPD病人中的数量和功能可能会下降,而增加p16表达式在保持特征细胞循环拦截方面发挥着重要作用26-28码..研究发现p16高表达式

histone后译修改是约束生命过程的主要子元机制,而直方形方程则因直方方位移用[29..Histoneatyl转移ase像p300/CBP一样,是一个关键转录共生程序,它涉及调控各种基因激活HAT使p300/CBP能够通过核直方修改来影响染色体活动现有数据显示Sp1和p300在数个基因转录调制中执行协同工作30码,31号..Sp1作为哺乳动物关键转录因子,与Sp1/HAT复合体的形成密切相关32码,三十三..eukaryote基因推广者Sp1可同时调用直方字actilase和deacyrace34号-36号..前文献报告p300击倒可减少表达式辰族galactosidase辰族内向细胞中松动内向细胞相似变化P300/Sp1中间高表达式p1637号-三十九..因此,在本研究中,我们进行了更深入的研究,重点是这一规范机制

二叉材料方法

2.1.临床样本

研究获中南大学第三院批准2018-056三组问题由18名非吸食非COPD病人、20名吸食非COPD病人和20名吸食CPD病人组成CCD病人定义依据全球慢性阻塞性肺病标准全球倡议标准 )CPD病人处于稳定的临床状态,至少四周内没有呼吸道感染或急性加重的证据。重症病人如哮喘、循环肺病、心衰竭和/或神经肌肉病不在研究之列(关于病人信息,请查补充表)一号)吸烟历史取材数寄生血样本(10毫升)逐个采集

2.2.EPC隔离识别

58个人义工样本 成功采集 本研究3组,每组收集约20名病人的血样血样收集成4-5批次,每批4-5名病人每批采集血液样本时,我们混合血液并取20毫升提取EPC作实验20ml血样稀释EGM中50mL消毒离心管(1:1) )含有淋巴细胞分离介质(Axis-Shield)的上层离心机管中添加同量稀释测试管2500分钟离心机室温度达30分,然后收集中间单细胞层并用非吸附器放入空离心机桶细胞用PBS冲刷两次,单细胞收集10%FBS或5%pHPL和10U/mLheparin细胞在12well板上培养鼠尾源1collagen(Termo,A1048301)和EGM介质隔夜孵化后收集非适应性细胞重置预热介质添加稀释细胞,从3口井分离出12口板和6口井24口盘,三次执行媒体头七天每天刷新一次,后七天则隔天刷新一次后端介质每2天或3天刷新一次EPC通过流体细胞测量识别使用CD34(ABCAM,AB64480)、CD133(ABCAM,AB19898)和VEGFR2(ABCAM,AB39256)反体EPC分离离心洗两次加磷酸缓冲saline细胞悬浮转至1.5mlEppendorf新管 单管细胞5华府CD34和CD133抗体和异型控件加进50华府L细胞悬浮基于流细胞测量指令推荐的抗体富集均匀混合后,装有抗体的细胞悬浮在4°C完全黑暗的冰箱内培养30分钟,三叉冲刷前冷凝层缓冲,离心机5分钟400克无界抗体冲走归根结底,细胞用500流管恢复华府链缓冲并检测流细胞流细胞测量结果使用FlookJo7.6软件分析和处理

2.3西布洛特

细胞三次浸泡PBS浸泡RIPA解析液并用BCA检测试剂检测蛋白浓度电压从60V变120V后,蛋白质用湿转电转到PVDF膜薄膜用5%滑雪牛奶TBST隔夜培养4°C初级抗体如下:1:1000MMP31:1000MMP131:1000,al11:1000+GAPDH1:5000)后来,薄膜培养马铃薯标注山羊反rabbitIgG(北京CoWin生物科学公司,中国)。后TanonTM高悬浮ECL西浮子公司(Sanghai Tanon有限公司,180-501)开发胶片,灰值由imageJ检测其后,蛋白质水平用目标带灰值与内部引用值之比表示(GAPDH)。

2.4.RNA提取和RT-PCR

全部RNA由TRIZol提取(ThemFisher, 1559(2004)6026)并用PCR放大工具反译入cDNA(Bio-Rad)。后使用ABI7500量化PCR仪(ABI7750,Exceer)实时测试,反应条件规定如下:95°C预达10分,95°C40周期达分10分,95°C40周期达分10分,60°C退约20分,72°C扩展34分样本用PCR或量化PCR分析immer p16配对如下: -TTCCTGGACACGCTGGT-3 反传感器5 -CAATCGGGGATGTCTGAG-3 .素数p300配对如下: -GACCCTCAGCTTTTAGGAATCC-3 反传感器5 -TGCCGTAGCAACACAGTGTCT-3 .素数双辰族Actin如下: -TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3 反传感器5 -ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3 .素数对Col1a1如下: -GCAGCTGGGTCCTCAGAAT-3 反传感器5 -CAGTTCCCCAGTTCCACTTC-3 .MMP3入门配对如下: -CAGACTTGTCCCGTTTCCAT-3 反传感器5 -GGTGCTGACTGCATCAAAGA-3 .MMP13入门配对如下: -CAGACTTGTCCCGTTTCCAT-3 反传感器5 -GGTGCTGACTGCATCAAAGA-3 .素数对Pal1如下: -TCTACAACAACGGATTGCCGTCC-3 反传感器5 -CACGGTGTTCTTCACCGCGTGC-3 .数据使用分析 方法带辰族Actin操作内部控件

2.5细胞循环流量测分析

细胞用Trypsin消化,固定70%乙醇,保存并存储4摄氏度夜间,然后50分悬停华府L磷酸缓冲带0.5华府L和10华府g/mlRNaseA和150华府碘化后用FACSCalibur量化细胞脱氧核糖核酸内容

2.6ChromatinImunopre降水

ChIP协议前文已描述40码使用抗乙基H4样本由PCR或RT-QPCR评估

2.7细胞移植

细胞移植前,EPC播入24行板块,0.5毫升约含 细胞中Plasmid转口使用LipoectaponTM2000(Exceer,1668030)基于Lipoectapon2000转口指令RNAi max(Invitrogen,13778075)根据制造商协议以免血清和无生素介质传输50Nmol/LsiRNASiRNA序列如下:Sp1 siRNA1:CCUGGOGUGOGAGCCUAATTSp1 sirNA2CAAGGAUUATP300sirona1:GCAGACACACCUAT300siRNA2:GCAACAUGAGAUT和p16sirna:AGACAGAGACTGA

介质转换后六小时完全生长条件细胞转接72小时后收割

2.8Immunofluorescence

细胞用PBS洗两次(5分钟/每次5分钟),固定4%半甲状腺素15分钟,孵化0.5%Triton/PBS6分钟,封塞(10%山羊血清,0.05%NAN30.2%Triton, 并稀释PBS37摄氏度30分接下去,细胞用荧光二级抗体充电一小时,DAPI染5分并密封最后,用联想显微镜(Leica SP5)照相细胞或用荧光显微镜观察细胞

2.9辰族伽尔屏蔽

以厂商协议为例 细胞染上SA辰族-gal活动使用细胞感知包(Millipore,KAA002)并使用imageJ和imageProPrime软件量化阳性染色

2.10细胞计数箱8

每一个板块都注射细胞 以实验群集为基对数增长阶段中的细胞编译成细胞悬浮,并设置投射密度 ,和100华府L细胞悬浮板装三口仿水井,每组注射百元华府L文化介质用于空控并隔夜37摄氏度注入5%CO2孵化器细胞计数箱-8和免血清DMEM混合体积比为1:10华府L/Well,然后注入37摄氏1H2孵化器450纳米吸附器使用微板阅读器测量,并记录板值

2.11路西法斯实验

P300和SP1由p16推送者驱动505b片段p16由PCR加p16F5放大 -CCAAACAC-CCCGATTCAATTTGGCA-3 和p16R5 -CCGCTGCCTGCTCTACCCCTCTCC-3 素数生成p16推介器PCR碎片克隆成PCR2.1-TOPO向量并验证序列48h转包后,LuciferaseReporter测试系统(them)用于检测,具体步骤符合相应的装箱指令单元格培养介质在每个洞中被丢弃,100华府L级 添加到每个洞中细胞液压30分钟,杂质由离散(1200rrm,1分钟)生成共20华府细胞解析液加到不透明96well板和100华府Luciferase检测试剂二类和100类华府海洋肾滑动试剂L依指令逐次添加Tecan无限F200/M200luciferase活动值 )由Tecan无限F200/M200多功能微板阅读器和 值作为每一井相对活动值用于统计分析

2.12统计分析

所有数据显示为 .两组数据比较 测试多组数据使用单向偏差分析分析数据分析使用SPSS17.0(SPSS公司,美国伊利诺伊州芝加哥)和GrapPad Prism 8.0(GraphPad软件,美国加利福尼亚州圣迭戈)。统计意义假设 显著差点确认 .

3级结果

3.1.p16高表达式

基本细胞素养程序p16可调节细胞抗争过程探索p16表达式 非吸食非COPD、抽非COPD和吸食COPD病人时,我们先隔离这些病人的外围血液EPC并用流细胞测量识别隔离细胞1(a))后经RT-PCR和Western布洛特检测出p16在不同组中的表达式,结果显示MRNA和p16蛋白质水平在CCD患者外围血液EPC中显著提高(图解图解1(b)并1(c))之后,我们进一步验证CSE是否会增加p16我们从非吸烟病人和非CSE集中度不同的非COPD病人的外围血液中培养EPCRT-PCR结果显示,p16表达式随着CSE集中度的增加逐步增加同时,西布洛特结果显示,p16蛋白质水平随着CSE浓度增加而大幅提高(图解1(d)并1(e))

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图1
P16高表达式外围血液EPC与非吸食非COPD病人隔离流细胞测量验证 隔离细胞为外围血间延细胞RT-PCR检测外围血液EPC表达式西布洛特检测p16表达式非吸食非COPD病人的外围血液EPC用不同浓度CSE处理,RT-PCR检测到p16表达式非吸食非COPD病人的外围血液EPC用不同浓度CSE处理,WesternBlot检测到p16表达式 , ,并 .
3.2高表达式p16禁止细胞活动

检测到EPC在非吸食非COPD、吸食非COPD和吸食CPD病人中扩散CCK8解析显示EPC吸食CPD病人扩散能力显著下降(图解)2(a))并发现低表达式p16可拯救这些病人内生细胞活动下降2(b))CSE处理过程期间,我们同时发现击败EPCs中p16表达式可有效阻塞CSE对细胞扩散的抑制效果(图解2(c))我们进一步分析非吸食非COPD、吸食非COPD和吸食CPD病人中的EPC细胞循环,分析结果显示所有吸食CPD病人EPC都出现G1/S相位缓存2(d))此外,我们击倒EPCs中吸食CPD病人的第16页,发现低表达式p16可营救这些病人中的G1/S级EPCs2(e))同时,我们击倒CSE处理的非COPDEPC细胞中的p16,并发现击倒p16会抑制CSE引起的G1/S阶段抓取2(f))

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图2
高表情p16EPCs推广细胞循环抓捕外围血液EPC与非吸食非COPD分离,吸食非COPD并吸食CPD病人,CCCK8检测细胞扩散siRNA击倒p16和CCK8检测细胞扩散CSE5%处理非COPD近距离血液EPC,SiRNA击倒p16和CCK8检测细胞扩散外围血液EPC与非吸食非COPD分离,吸食非COPD并吸食CPD病人,细胞循环通过流细胞测量检测吸食CPD病人的外围血液EPC分离,SIRNA击倒p16,细胞循环通过流细胞测量检测非吸食非COPD病人的外围血液EPC用5%CSE处理,p16由siRNA击倒,细胞循环通过流细胞测量检测
3cm3CSE计量p16超表情推广细胞敏锐

调查高表达式p16对内代子细胞异端效果辰族凝固染色并检测出 evenence相关基因表达上头辰族Gal染色实验显示CSE可增强EPCs的守信性并发现击败EPCs中的p16表达式会抑制CSE引起的细胞隐蔽性3(a))显性染色显示CSE高表达式Lamp1显示体积增加、细胞高自发性提高和EPC抗争度提高,同时击倒p16会将Lamp1表达式减到一定程度(图一)(图一)3(b))同时,我们也检测到 evencience相关基因表达感知基因Cola1MMP3MMP13和Pal1在ECPs使用CSE处理时表现高清晰度,而这些基因表达方式则因p16击落而受阻塞(图解推倒3(c)并3(d))

(a)
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图3
CSE中间高表达器p16促进细胞守默非吸食非COPD病人的外围血液EPC用5%CSE处理,p16由siRNA击倒,evenence细胞比例计数 辰族形体染色非吸食非COPD病人的外围血液EPC用5%CSE处理,p16由siRNA击倒,Lamp1表达式通过免疫检测非吸血非COPD病人的隐型EPC用5%CSE处理,p16由siRNA击倒,evenence相关基因表达式col11a1MMP3MMP13和Pal1由RT-PCR检测非吸血非COPD病人的隐型EPC用5%CSE处理,p16由siRNA击倒,evenence相关基因表达式col11a1MMP3MMP13和Pal1由WesternBlot测试 , ,并 .
3.4.提高p300表示法提高p16

先前研究报告p300可规范p16转录活动,高表达度p300可促进细胞循环抓取41号..并发现在非吸食非COPD中,吸食非COPD并吸食CPD病人中,P300在吸食COPD病人外围血源细胞中的表达量比其他2组高得多(图解图)。4(a))细胞用CSE处理和p300表达式倒置时,p16表达式也下降,如RT-PCR和Western布洛特结果所显示(图解)4(b)并4(c))小分子抑制器P300C646添加到CSE处理EPC时,我们发现p300活动下降会在某种程度上抑制p16表达式并发建议表示p16高表达式由CSE调试,p300极有可能成为p16上游可能的笔录调控器

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图4
提高p300调高p16西方布洛特检测外围血液中的p300EPC表达式非吸食非COPD、吸食非COPD和抽取CPD病人集20样本siRNA击倒p300和RT-PCR检测p16表达式siRNA击倒p300和WesternBlot测试p16表达式d) 非吸食非吸食性昆虫EPC用5%CSE和p300小分子抑制器C646处理,P16表达式由RT-PCR检测非吸食非CSE和P300小分子抑制器C646并用WesternBlot测试p16表达式 , ,并 .
3.5P300/Sp1规范p16轨迹活动

先前研究显示p300函数解析多细胞响应,如细胞循环进化和细胞分化,这一过程依赖转录因子spSp1同时引导前置综合体组成p16推介器-464至-452b41号,42号..验证信号路径是否也能调节ECS介面的异性,我们首先在ECP中高报300分量并检测p16推介者活动Luciferase解析发现p16推广者活动因p300表达式增加而增加5(a))Sp1过分表达还可能促进p16推介者笔录活动5(b)spl击倒p300或Sp1会抑制p16推介者转录活动5(c))P300/Sp1高表示或击倒EPCs并发现p300/Sp1高表示EPCs高表示P16,而p300/Sp1击倒抑制p16表达5d并5(e))ChIP解析显示,p300/Sp1高表达度推介p16推介区h4剖析值,而击倒这两个基因则产生相反效果(图解图解)5(f)并5(g))以上结果显示p300/Sp1联合参与ECS介面中高p16表达式

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图5
P300/Sp1规范p16转录活动微信多报p300,p16推广者活动由luciferase检测Sp1的不同量在EPC中表达过量,P16推广者的活动由luciferase检测P300/Sp1EPCs击落,P16推广程序活动由luciferase检测P300/Sp1在ECCs中表达过量或击落,RT-PCR检测到p16表达式P300/Sp1表达或/并击落EPCs和WesternBlot测试p16表达式P300表达或/并击倒EPCs, ChIP检测到p16推介区extoneH4菌变素水平Sp1表达或/并击落EPCs,ChIP解析检测p16推介区等级h4数字中所有EPC都来自非吸食非COPD病人 , ,并 .
3.6.低表达式p300/Sp1

进一步证明p300/Sp1规范ECS高表达式p16都行辰族-Gal污点和Lamp1免疫素实验显示击败p300或Sp1可抑制CSE在某种程度上介导细胞6(a)并6(b))流细胞测量结果也显示击倒p300或sp6(c))同时,我们还检测出与隐性基因Col11、MMP3、MMP13和Pal1的表达方式,发现击倒p300或Sp1也可能抑制CSE高介面这些隐性基因到一定程度6d并6(e))此外,我们还进行了营救实验或SE处理EPCs高表达式p16高度表达p16后,mRNA和evenence相关基因Col11、MMP3、MMP13和Pal1的蛋白质水平大增,显示CSE规范p16至p300或Sp1表达方式,从而引起ecse6(f)并6(g))

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图6
低表达式p300/Sp1抑制cSE居中外围血液EPC用5%CSE处理,p300/Sp1由siRNA击倒 辰族形体染色外围血液EPC用5%CSE处理,p300/Sp1由siRNA击倒,Lamp1表达式通过免疫素检测外围血液EPC用5%CSE处理,p300/Sp1由siRNA击倒,细胞循环分布通过流细胞测量检测外围血液EPC用5%CSE处理,p300/Sp1由siRNA击倒,evenence相关基因表达式col11MMP3MMP13和Pal1由RT-PCR检测外围血液EPC用5%CSE处理,p300/Sp1由siRNA击倒,siRNA测试seence相关基因表达式Col11MMP3MMP13和Pal1由WesternBlot测试f) 阴性EPC用5%CSE处理,p300/Sp1由siRNA击倒,p16表达方式过大,Seence相关基因表达式col11MMP3MMP13和Pal1由RT-PCR检测外围血液EPC用5%CSE处理,p300/Sp1由siRNA击倒,p16表达方式过大,evenence基因表达式Col11MMP3MMP13和Pal1由WesternBlot测试数字中所有EPC都来自非吸食非COPD病人 , ,并 .

4级讨论

青蒿素综合症是最常用的呼吸系统疾病,第四大死因遍及全世界以累进气流阻塞为特征,该阻塞响应有害粒子或气体,特别是烟雾,并关联空气道和肺扰动过程43号..致病机制尚未完全发现研究发现p16表达式在CPD病人EPC中增加,禁止细胞活动,促进细胞循环抓捕,增强脉冲内延细胞的灵敏性广度EPC是血管健康的重要生物标志前几次研究显示,CPD病人有一定程度的脉冲EPC下降研究显示,下降ECP极有可能由吸食诱发的p16表达式增加所引起并发现CSE提高p300/sp1表达式,重要的是,我们的研究证明CSE真正促进COPD的进展,为解释COPD发源提供理论基础

istoneatyltractionasep300是一个转录激活器,它最初是在寻找乙型病毒致癌分解因子E1A中发现的,后来证明它有exoneatyltractionase活动44号,45码..小鼠的肺组织暴露于烟雾中,CSE引导的人类支气管上侧细胞显示直通H4K12化位knockdownp300可减少表达式辰族galactosidese并慢化内接合细胞的异同变换46号..研究发现p300调控p16表达式高通H4K12对通缩度调控,激活ecense相关因素表达并增强ecsseP300转录激活器,同样值得研究的是p300除p16外是否会激活其他转录因子同时,我们不完全知道为什么P300高表达式在PCD患者外围血液EPC

histone修改酶受全景分解路径约束置换信号被视为蛋白质退化47..而在细胞中,无处不在蛋白选择降解主路,它主要作用于某些约束性蛋白短半衰期和某些结构异常、误配置或细胞内受损蛋白以调节细胞活动48号,49号..Rom等[50码发现烟雾接触可激活无处不在蛋白路径,导致骨质肌肉分解和细胞损伤Jeong等[51号setyl转移asep300并值得研究的是,人体中是否存在由冒烟诱发deuquitianse激活,通过稳定p300蛋白表达方式、提升extone H4K12的容积度并启动evencience相关因素转录程序,增强EPCs参与CPD过程的常识性

研究限制主要在于分析覆盖有限病人群研究中选择的COPD病人主要是急性增量,无稳定病人同时,既然我们研究从多位病人外围血液提取的直系子细胞,而没有具体比较A-D级复发细胞p300/p21活动,我们的研究无法完全代表全方位复发病人

据报道,在早期复发器患者中,EPC数增长,EPC帮助修复和重建肺容器,而在晚发复发器患者中,EPC流转数下降[52-54号..在这次研究中,我们没有探索四位病人循环ECC数函数变化后续研究将深入探讨上述问题

总体说来,我们的研究发现P16和P300外延血液EPCs此外,p300/Sp1提高p16推介器区域exoneH4剖析级

数据可用性

支持本研究发现的数据可应相关作者合理请求提供

道德验证

研究获中南大学三合院批准,湖南市长沙

书面知情同意从所有主体获取

利益冲突

发件人声明,本文章的发布不存在利益冲突问题。

作者贡献

梁G和彭H构思研究,进行实验和数据分析并起草手稿高M、增M和张X实验并收集资料赫兹构思研究设计 并严格修改手稿志辉研究设计 数据采集 统计分析 手稿写作怀怀平和敏高采集样本并帮助写手稿桂滨梁完成手稿设计、数据解析和写作孟化增解写手稿所有作者阅读并批准最终手稿

感知感知

这项研究得到了中国自然科学基金会(887040)的支持

补充素材

补充表1:本研究中病人详解的人口特征和临床特征高山市补充素材)