抽象性
微滑动细胞和随后神经炎反应与各种退化脑病相关微滑动细胞规范是治疗剂研究的一个重要点 治疗或预防神经退化失序sausureae Radix(SR)是根苏素拉大腿克拉克在东亚长期使用草药处理消化系统消化不良和炎症但在前几次研究中,SR乙醇提取对微滑动细胞介导神经发泡作用没有充分解释研究中,我们探索用LPS(lioplysc实验结果显示SR不引起细胞毒性并大大削弱一氧化二氮和发炎性细胞素的生产SR处理还抑制可引导一氧化二氮合成物2和环氧子系统2的表达方式,并激活核因子二相关因子2(Nrf-2)路径此外,SR大力抑制核因子校验活动-NF-百货公司启动者蛋白质-此外,SR有效禁止二元激活蛋白质动画片和Januskinase/信号传感器和转录机隔离高性能液相色谱分析显示二大sequiterpenoids这些复合物严重抑制神经炎调试器和HO-1导演表达研究结果显示SR可能成为治疗与炎症有关的脑退化性疾病的潜在候选者
开工导 言
微lia是重要的免疫细胞, 并扮演脑中中神经系统关键角色正常情况下,他们持续清除CNS异常脑细胞和病原体,并帮助调节语法全新[一号..微lia激活条件产生神经毒物生成,如炎性调试器和蛋白质,所有这些都与神经退化失序相关2..PS作用原型异多福因,诱发炎症、败血症和死亡LPS因此常用创建试管内模型发炎3..受LPS启发时激活条件中MAPKs转介信号路径,如转录因子NF-NF-百货公司B和AP-14..AP-1和NF-百货公司B密切关联生成炎性分子,包括iNOS和cytokines5..此外,JAK/STAT是另一个重要路径,通过释放生长因子和阻燃性细胞素[6..管理MAPKNF-百货公司B、AP-1和JAK/STAT路径对治疗煽动性疾病可能很重要
HO-1促进Heme分解成一氧化碳和二维丁HO-1教程高,并表现在许多神经细胞中,包括HT22和BV2细胞中7..此外,HO-1禁止生成发炎因子,如NO和发炎性细胞素8..HO-1及其副产品CO减少iNOS表达式,从而减少iNOS派生NO九九..HO-1生成由激活依赖转录因子Nrf-2导出10..发炎过程中免费Nrf-2移位核并随后导出HO-1制作11..最近的一些研究确认HO-1对免疫性或防炎效果的重要性
长效药草处理消化系统各种疾病前几次研究报告,SR可提高大鼠ethphon诱导生殖毒性并减轻Nc/Nga小鼠家庭灰度mte诱导式类皮炎12,13..另一项审查研究表明SR物证防癌学、防炎学、抗溃素学和焦格特效14..然而,SR及其分子机制对微滑动细胞神经发光的影响仍然未知。本研究用BV2微滑槽刺激LPS研究SR对神经发泡及其机制的抑制效果评估苏维埃主要成分抗神经炎效果时,我们分治两种主要的sequiterpenoids,Costunolide(1)和dehitcoclistone(2)并用HPLC分析对两个孤立复合物进行了量化调查,我们探索了该复合物的抗神经炎效果
二叉材料方法
2.1.材料和试剂
Dulbecco修饰鹰介质(DMEM)、胎儿牛血清(FBS)和抗生素均取自Hycrone(Logan,UT,USA)。LPS、Deximathaone、BSA和二甲基二亚二联Louis,MO,USA)100毫米文化盘和6-96-well板从Sarstett获取(德国纽比特市)。手机计数包从Dojindo购买(日本熊本市)。EBioscience公司(圣地亚哥州CA州美分局)获取了与寄生体相联的免疫感应测试机集从细胞信号技术公司购买各种原生抗体和马劳氏二次抗体和Novus生物学Alexa Fluor488相容二级抗体取自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。RNA提取包取自iNTRONBiotechOligonucleotide实时反转录聚合物链响应系统(RT-qPCR)、DNA合成包和AccuPower2xGreenStarqPCR MasterMix从Bioneer获取SR乙醇提取量(使用100%乙醇)取自韩国植物提取库(韩国Ochang)。
2.2.细胞文化测试戒毒
BV2细胞在DMEM生长(含1%抗生素和10%FBS)并注入5%CO2大气37摄氏度微lia使用LPS(100纳克/毫升)时有或无SR(1、10、50或100)使用华府g/mL成本unolide(1、10或25华府m)脱水片段(1、5或10)华府M)或DMSO(0.1%,车辆控制
2.3细胞可行性测试
CCK解析检验SR潜在的细胞毒性BV2细胞播种并预注入18h,细胞中添加各种聚积SR、DMSO或LPS输入24h后添加并插入CCK解法手机可行性计算取450纳米光密度使用ELISA阅读器
2.4.NO机密分析
通过测量文化介质中的亚硝酸浓度检验NO水平BV2细胞板块化、前插SR、costunolide、dehitcostlicone或DMSO为1H值并用LPS为24H值接百华府Lsgries试管加到每口井5分钟室温孵化后,使用ELISA阅读器测量570纳米
2.5ytokine判定
ELISABV2细胞播种18小时细胞预处理数集SR、costunolide、dehitcostlicone或DMSO为1H后再加LPS6H培养介质的发炎性细胞素量由ELISA抗体测算
2.6RNA提取和RT-qPCR
RNA总抽取和CDNA合成工作分别使用易BLUETMRNA抽取包iNTRONBiote15..实验设置、特殊方法以及RT-qPCR条件都指向前研究方法15..表显示本研究中使用的olioucleotide素数序列一号[15..放大分析使用QuantStudio 6Flex实时PCR系统(TermoFish科学,Rockford,IL,USA)进行,每个样本都比较相对CT法RT-qPCR结果显示为基因感应折叠式使用内部控件计算
2.7准备全循环核提取
求取全细胞解析器时,放射性模拟喷射解析缓冲器(Millipore、Bedford、MA、USA)重新悬浮粒子,内含原生素和磷气抑制器单片核分片使用NE-PERTM核提取试剂和单片提取试剂
2.8西布洛特分析
全蛋白使用Bradford法解析16..蛋白质使用二叉酸钠聚变电阻分离并转至聚聚乙烯氟膜(Millipore,Bedford,MA,USA)。使用3%BSA阻塞非专用绑定网站后,4摄氏度整夜向每个主抗体注入膜膜后与每个HRP相容二级抗体并发Protein水平使用ChemiDocTM触摸成像系统量化各类初级和二级抗体信息表列2.
2.9隐性隐蔽
BV2细胞隔夜播种使用SRS和LPS处理后,BV2细胞为1孵化百货公司Bp65或3h细胞三次冲刷磷酸盐缓冲盐酸盐并固定为4%阻塞后,固定细胞在4摄氏度对准主抗体隔夜浸泡,三次用PBS冲洗,并用Alexa流488同构二级抗体孵化细胞用4,6二联苯卓10分室温观察并用荧光显微镜观察17..
2.10植物素材
2016年首尔Bomyeong草药市场提供driedSR科学名由作者之一识别微里凭证样本(ID-160078)存放于大韩民国东医学院Herbior韩国医学应用中心
2.11采掘隔离
干SR(500.0g)三次使用EtOH(1.5L)抽取回流EtOH总提取量(80.0g)悬浮分解水并分解EtOAc和水分生成EtOAc(1A38.0g)和水(1B41.5g)。EtOAc分片受 silica列色谱和梯度为exne-EtOAc-MeOH1A-1A-11分数1A-2带梯度H2O-MEOH(1:4,1:3,1:2和MEOH)由MPLC使用YMCCC18列提供8分数1C-1C-8分片1C-2用SephadexLH20列分离并排除MeOH,分片分片用p-HPLC隔离分解为复合1(460.0mg; )和复合2586.0mg )
2.12样本准备HPLC分析
HPLC标准储量解析法是用100%甲醇(1 mg/ml解析精重复合物SR提取量浓度为10 mg/ml所有解析方法都通过0.45过滤华府mRC膜注射器滤波器(Sartorius,德国)。
2.13优化色谱条件
HPLC分析使用DionexUltiMate3000系统(DionexCorp.Sunnyvale,CA,USA)进行,系统配有二进制泵、自标器、柱式炉和二极数组UV/VIS检测器系统控制数据分析使用dionex Chromeleon软件LunaC18列分离 mm5华府m, Phenomenex,Torrance,CA,USA),列炉温度保持在30摄氏度,紫外线波长200纳米移动相片由水(溶解A)和甲醇(溶解B)组成,25分75分0-20分,B分75+100分20-30分流率1.0mL/min
2.14验证方法
线性标定曲线用稀释五大富集度绘制线性通过计算相关系数评估 )二复合标定曲线五聚复合物用三重分析回归方程使用方程计算 ,去哪儿 并 集中区和峰值区
2.15统计分析
所有数据都显示为 三次独立实验使用单向偏差分析分析统计意义,然后由Dunnett测试比较LPS和每个处理样本统计意义定义为 .
3级结果
3.1.SR对BV2细胞可行性的影响
为了检验SR对BV2细胞的潜在细胞毒性效果,CCCK解析图中显示1(a)使用SR处理华府24小时g/mL无细胞毒性并观察到小量扩散华府g/ml.0.1%DMSO汽车控件对细胞可行性没有重大影响
(a)
(b)
(c)
d)
e)
f)
g)
3.2SR对NO和Cytokines保密的影响
研究反神经炎效果SR时, 我们使用Gries解析法对LPS启发后NO生成作首次评估图中显示1(b)LPS处理强高NO水平,而预处理SR则以依赖浓度方式显著减低NO生成并使用ELISA和RT-qPCR表示他们的mRNAs图中显示1(c)-1(g)LPS处理细胞强增肿瘤坏死因子-αyleukin-IL-6及其mRNA水平,而SR处理则以依赖浓度的方式抑制citowine和mRNA水平此外,0.1%DMSO处理(车辆控制)不影响神经炎调试器制作
3cm3SR对iNOS和COX-2表达式效果
下一题研究蛋白质和mRNA表达式iNOS和COX-2综合NO和prostaglandinE2..结果表明,预处理与SR有效抑制LPS诱发iNOS和COX-2表达式2(a)并2(b))
(a)
(b)
(c)
d)
3.4.SR对HO-1和Nrf-2核移位的影响
HO-1有效导引SR预处理,甚至在LPS启发下HO-1蛋白质表达式华府g/mlSR和mRNA表达式由100引导华府g/mLSR2(c)并2(d))Nrf-2核移位管理HO-1传导的分子机制也因SR而提高,并随着SR浓度增加而增加移位范围2(d))光学成像校验Nrf2核移位BV2并获取类似Western染色结果2(d))
3.5SR对NF-百货公司B级
因为NF-百货公司B路径在神经炎过程中起关键作用, 我们检查SR抑制I百货公司B级α和NF-百货公司PS模拟微lia中的B反作用西方布局显示SR有效抑制p65移位从细胞图层转核3(a))此外,SR强减I百货公司B级αLPS启发3(a))核移位p65使用免疫光学成像识别后根据西方染色结果被SR预处理强压3(a))
3.6.SR对MAPK磷酸
MAPK磷化多发性因子生成因此,我们分析三种MAPK变换法,包括外细胞信号调控动脉冲,p38和c-JunNH2终结异端图结果3表示SR预处理抑制APPKs激活,包括ERK、P38和JNK
3.7SR对LPS引文AP-1启动
AP-1迁移核心并规范某些炎性基因表达方式,以响应刺激引起的炎症,如LPS6..因此,我们测量PC-1级和核AP-1级的磷化水平图中显示4(a)LPS启发C-Jun磷化并迁移到核核中,而预处理SR抑制C-Jun核转移和磷化C-Fos核移位是AP-1的另一个子单元,用SR预处理以类似方式被抑制4(a))
(a)
(b)
3.8SR对激活JAK/STAT路径的影响
前次研究报告称,JAK/STAT路径的缓解阻塞NO分治18号..因此,我们在LPS模拟BV2细胞中测量SR对JAK2、STAT1和STAT3磷化抑制效果图中显示4(b)SR处理严重阻塞JAK2、STAT1和STAT3的磷化
3.9隔离结构说明
使用染色分解技术后,costunolide(1)和dehitcoclistone(2)实际上与SR隔开5)HPLC评价显示隔离复合物纯度>95%结构通过比较所获光谱数据与先前报告值确认19号..
310验证Costunolide和Dhitcoclistone微lia对LPS模拟
研究细胞毒性 SR主要成分, 我们执行CCK测试微lia图中显示6(a)成本unolide显示25下富集无细胞毒性华府m和dhitcoclistone浓度低于10华府M.两种构件显示轻细胞毒性,富集度大于25华府M和10华府后继实验仅使用低于该值的浓度Costunolide和dehitcoclistone有效抑制LPS启发NO和Citkines生产6(b)-6dmRNA表达式大全并依赖集中抑制6(e)-6(g))此外,图中显示6h-6jmRNAiNOS和COX-2级通过成本分解预处理强抑制,反氧化酶HO-1mRNA表达法有效导引0.1%DMSO用于车辆控制对细胞可行性和神经炎调试器生产没有影响在上述多数结果中,Costunolide和dehitcoclistone分别显示依赖浓度作用并具有统计意义
(a)
(b)
(c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
(j)
3.11HPLC-DAD分析识别SR组件
移动级由甲醇和水组成使用PDA检测器检测出2标准SR二百纳米波长按最大波长选择对比保留时间和紫外光谱两种标准(cocunolide(1)(9.39分钟)和dehitcoclistone(2)(10.68分钟))和SR,检测到两种复合物7)
(a)
(b)
(c)
3.12HPLC分析法验证
取两种化合物标定曲线的方法是绘制峰值区与集中度线性相关系数 )标定曲线大于0.9993)根据标定曲线 发现二类化合物 并 mg/g,
4级讨论
微滑细胞介导神经发泡已被确定为神经退化疾病的一个重要风险因素。显性细胞过度激活导致神经损伤、脑损伤和释放各种神经炎调试器20码..通过微滑动调控降低这些内生发炎因素水平对预防和治疗神经发炎[21号..SR为干根苏素拉大腿Clarke(Compositae)原生于印度喜马拉雅SR列载古医学文文文“Slegen's Sqrie Medica”,东亚长期用于消化失序处理,如消化不良、呕吐、胃痛、腹泻和消化系统慢性炎SR还被用于治疗痢疾和睾丸炎,最近的一些研究显示SR可提高大鼠的生殖毒性并减轻小鼠室内灰尘mite诱导自控性皮炎[12,13..此外,最近的一项审查研究描述,SR物证防癌学、防炎学、抗溃素学和焦格特效14..此外,最近另一项研究表明SR有抗氧化物和抗神经炎效22号..然而,上述工作使用乙乙酸微分SR并显示NO、iNOS和TNF-α细胞基生产22-二联苯-1-picry本研究显示SR抑制生成IL-6IL-1等神经炎因子辰族和COX-2和NOBV2细胞受LPS启发通过调查SR对NF-NF-百货公司B、MAPK、AP-1和JAK/STAT路径并识别SR激活HO-1/Nrf-2抗氧化物路径的功效
首先,我们进行了CCK检测排除SR对BV2微滑动细胞的潜在细胞毒性,SR对细胞可行性的影响最大不超过100华府g/ml.此外,50多点确认BV2细胞扩散华府g/ml处理1(a))NO为自由基23号..NO由iNOS从L-argini24码,25码..NO分解iNOS表达式级别与HO-1感应关系密切26HO-1受Nrf-2约束因此,我们检查SR预处理是否抑制微滑动细胞内LPS刺激神经炎过程产生NO、炎性细胞素iNOS和COX2实验结果显示SR显著减少NO、炎性细胞素及其无细胞毒性mRNAs的生成一号并禁止iNOS和COX-2蛋白和mRNA表达具有统计意义2(a)并2(b))并激活Nrf-2并逐步增加Nrf-2核移位并具有统计意义2(c)并2(d))SRHO-1感应和Nrf-2激活效果似乎对约束神经炎响应产生间接效果,抑制NO和iNOS
NF激活百货公司B和MAPK与CNS各种疾病的发病相关NF-百货公司B是控制各种基因的主要调节者 与免疫和炎热反应27号..视LPS微lia激活百货公司B级α变质和磷化,免费NF-百货公司B移到核心并启动煽动性调停程序28码..MAPK在LPS引导的内生煽动调试器和激活NF-NF-百货公司B[29,30码..我们研究SR对煽动性调停者的影响 是否与NF-NF变化相关百货公司.b.结果显示 处理SR有效抑制NF核移位百货公司Bp65依赖集中方式3(a))此外,SR处理抑制I磷化退化百货公司B级α相似模式3(a))sp启发显示Mapk激活通过禁止ERK、P38和JNK的磷化有效抑制SR处理3(b))结果表明SR抑制神经点火效果可通过阻塞NF-NF-百货公司B和MAPK路径
AP-1子单元激活和核移位规范LPS导出发炎响应中某些发炎基因表达6..JAK/STAT路径已知通过磷化生成各种煽动性调停器,并被公认为在煽动性响应中起中心作用[6,31号..此外,STAT3磷化直接作用IL-6分解32码..测试结果显示,SR预处理抑制c-Jun磷化和核移入c-Fos核心4(a))SR预处理有效抑制JAK2、STAT1和STAT34(b))结果表明苏维埃反神经炎活动可归结为NF-NF-百货公司AP-1路径和JAK/STAT路径受抑制
我们还用HPLC分析确定二大组件(cocunde和dehitcoclistactone)此前对这些组件的研究显示,成本团结通过减压MAPK改善急性肺损伤,并通过停机NF-NF-改善小鼠急性螺旋百货公司STAT1/3和Akt三十三,34号..还有一些报告显示脱水单抑制LPS诱导宏集激活NF-NF-百货公司B,p38MAPK和Akt35码..反水电分片有效抑制LPS诱发炎试管内提高小鼠在采样绑定和穿孔诱发败塞维沃[36号..研究显示SR抗neuroinflactive效果与其成分效率、成本单片和去水分单片密切相联以确认这些复合物反神经炎活性,我们调查Costunolide和dehycostusactone对生成NO、prolimaticalCytokines、mRNAs煽动性mRNAs和抗氧化酶HO-1对微lia的影响检测结果显示这些复合物禁止生成NO和炎性细胞素,包括TNF-α和IL-6无细胞毒性6(a)-6d)两种化合物还以依赖浓度方式抑制Citokine、iNOS和COX-2mRNA表达式6(e)-6i)excostuslactone强导HO-1mRNA表达式6j)基于上述结果,SR神经炎响应的调控效率被认为与Costunolide和dehycostusactone对生成煽动性调试器的抑制效果密切相关。
研究结果显示SR含有抗神经炎特性试管内减压LPS模拟BV2单元阻塞调频器HO-1/Nrf-2增强激活并抑制NF-百货公司APPK/AP-1/JAK/STAT信号路径苏维埃反神经炎效果似乎与两种成分即成本分解器和脱水分解器的存取密切相关。基于这些结果,SR似乎具有潜在价值,可申请治疗与发炎有关的脑退化性疾病
缩写
| AP: | 激活者蛋白 |
| BSA: | 波文血清相册 |
| CCK: | 手机计数工具箱 |
| CNS: | 中枢神经系统 |
| CO: | 一氧化碳 |
| COX: | 循环生成 |
| DAD: | 二极数组UV/VIS检测器 |
| DAPI: | 4,6-Diamidino-2-phenylindole |
| DEM: | 杜尔贝科修饰鹰介质 |
| DMSO: | 二甲基二氧化二 |
| ELISA: | 神经联动免疫感应测试 |
| ERK: | 外细胞信号调控 |
| FBS: | 胎儿牛血清 |
| HO: | 赫米氧气 |
| HPLC: | 高性能液色谱 |
| HRP: | horudish过氧化 |
| IL: | Interleukin系统 |
| 诺斯: | 可引导一氧化二氮合成 |
| JAK: | 亚努斯friase |
| JNK: | C-JunNH2终结异端 |
| PS: | Lipopolysaccharide |
| mapk: | 寄生蛋白动脉 |
| NF: | 核因子 |
| 号: | 氮氧化物 |
| Nrf-2: | 核因子2相关因子2 |
| PBS: | 磷缓冲盐碱 |
| RT-qPCR: | 实时逆转转录入聚合物链响应 |
| SR: | 松树拉迪 |
| stat: | 信号传感器运算符 |
| TNF: | 肿瘤坏死因子 |
| VC: | 车辆控制 |
数据可用性
支持结果的数据可应请求从相关作者处获取
利益冲突
作者声明不存在利益冲突
作者贡献
张吴开发研究设计 实验分析数据 写手稿 严格修改手稿微信实验分析数据 并分析植物化学Jang-GiChoi实验分析数据所有作者都为文章投稿并批准提交版
感知感知
韩国东医学院Grant KSN2013230支持此项研究,由大韩民国科技部提供