抽象性
后台.长非编码RNAs(ncRNAs)有生物和病理活动关键调控功能解释表达模式并显示新识别 IncRNAs底层机制非常重要方法论.使用IncRNA微数组筛选骨髓肿瘤和细胞线中的微表达式IncRNAs候选IncRNA经qRT-PCR进一步验证,京都基因百科全书路径分析评价基因表达与临床病理特征目标MIRNA使用星际数据库分析识别,STRING建立竞合内生RNA网络qRT-PCR检测到RNA过分表达和沉默steosorcoma细胞扩散用CCK-8测定,迁移入侵用Transwell算法评价群落构造检测流细胞测量评估细胞循环西方染色体检测线性标记和potosis相关蛋白鼠标裸肿瘤编组实验用于评价骨形演程维沃.coover表达式MIR-34b-3p与RAD51反转MIR-34b-3p引起扩散变化、细胞循环、H2A.X表达式以及与pototosis相关蛋白质表达式结果.HCG9被识别为与osteorcoma关联 IncRNAOSCOOM组织与细胞线表示HCG9比正常组织和骨质高,HCG9高表达法进一步证明与转移和骨质相关击倒HCG9抑制生物细胞扩散、迁移和入侵mir-34b-3p被确定为HCG9目标,RAD51被确定为mir-34b-3p潜在目标mir-34b-3p同HCG9部分抑制HCG9模拟扩散、迁移和入侵骨形细胞试管内并延迟肿瘤增量维沃.结论.incRNAHCG9通过抑制 mir-34b-3研究提供新生物标志和潜在治疗目标
开工导 言
OSTEOSOMA是最常用主骨恶性一号..尽管诊断、化疗和外科技术有所进步,但骨质瘤预测仍然差强人意局部骨质瘤的长期生存率77%,而当转移发生时该疾病会变得更加致命,据美国癌症协会统计,长期生存率下降至26%。微信镜底层分子机制尚不清楚,但已扩大广泛努力探索更有针对性的局部处理esteosorcoma2..随着对分子病理生成知识的提高,基因理疗已成为对骨科马的受控、定向和特殊处理3,4..
超过90%的人类基因组不编码蛋白质5..长非编码RNAs类NcRNAs含有200多核素越来越多的证据显示,Dis受控IncRNA基因表达方式与肿瘤增量相关6-8..由Li等人对osercoma IncRNA作首项研究,他们通过IncRNA表达式微数组识别steoscoma400调高和798调低IncRNAs九九..加奥和连报告IncRNA MALAT1独立预测分量10和另一个IncRNAH19被证明11..HCG9还被称为人类lekocyte抗原复合类9基因,研究报告HCG9与肺脏细胞癌相关12和鼻孔癌13..然而,HCG9在osteoscoma的作用仍然未知
IncRNAs的一个主要功能是作为竞争式内源RNAs管理IncRNA/miRNA/mRNA交叉轨迹14..CERNA假设由Salmena等人提出[15..假设IncRNA通过局部补充完全绑定网站,这导致MIRNA活动减少mRNA规范自那以来,许多研究者验证了这一理论16..span等IncRNAFBXL19-AS1海绵MIR-346规范骨细胞扩散17..郑等incRNASNHG3/MIR-151a-3p/RAB22A函数轴以规范osercoma入侵和迁移18号..然而,许多潜在的IncRNA/miRNA规则还有待确定。
研究中,我们进行了IncRNA微数分析 并识别HCG9据我们所知,这是首份报告 连接HCG9并锁定目标MiRNAMIR-34b-3HCG9和MiR-34b-3p之间的交互作用经生物信息分析与分子生物分析验证,我们还报告RAD51是MiR334b-3p的潜在下游mRNA目标HCG9击倒和高表情对osteorcoma细胞的影响试管内和肿瘤增量维沃被评价实验结果提供新生物标志 steosorcoma并揭示基础机制的理论基础
二叉材料方法
2.1.IncRNA微数组芯片和生物信息分析
IncRNA骨形组织中的基因表达法和parcarcinoma组织分析GE227数据库数据集https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)用作参考单变量Cox回归分析用于识别微分表达式IncRNAs最小值 -肿瘤组织与正常组织间基因表达式变换 屏蔽癌症细胞百科全书数据库被用作验证癌症细胞中HCG9表达式的参考
steosorcoma生存信息用于生成卡普兰-Meier单存分析并日志排序测试京都基因和组百科全书路径分析建立HCG9与骨形学临床特征之间的联系
ceRNA网络生成时评估蛋白质与标准组合 String2017发布 .可视化蛋白-蛋白交互网络使用Cytoscape软件获取(3.6.1版)。分子复杂检测(MCODE1.31版)被采纳识别PPI网络中的重要模块和顶级基因
2.2.组织集合
共招集了47名从二院摘肿瘤手术的病人向同意本研究所有调查的病人收集了15对骨架组织病人在手术前都得到通知并签名书面同意二医院机构评审委员会批准了所有程序和组织采集协议组织标本存储液氮或固定10%正则
2.3细胞培养转换
Osteoblast细胞线hFOB1.19和osteoscoma细胞线U2OS、MG-63和MNG/HOS均从ATCC购买(ManassasVA)。细胞培养Dulbeco修改老鹰中型机(DMEM)(Gibco)内含10%子牛血清2大气37摄氏度sRNAs和负控件从TermoFish科学公司购买MiR-34b-5p从Qiagen购买负控件转接程序使用Lipoectapine2000(themFish科学,Waltham,MA)根据制造商协议完成细胞采掘后48小时描述
2.4.transwell解析
细胞迁移和入侵都用Transwell系统评估迁移解析 细胞悬浮百分华府L免血清DEM并播送上院8华府m孔尺寸 Transwell板块入侵实验上院8华府m孔尺寸 Transwell板与MatrigelTM矩阵预包(BD生物科学公司,CA,USA) 细胞播种并培养免血清DEM
两种推理总容量500华府LDEM内含10%胎儿牛血清24h文化后,底表迁移入侵细胞固定为4%伪冒并染为1%晶紫细胞用Zeiss直立显微镜观察染色用33%乙酸冲刷,590纳米吸附用微板阅读器分析
2.5细胞计数箱8
细胞扩散用CCK-8解析评价(日本道津道)。野型控件转基因细胞采集并播入96well板块三次技术重复为每组执行固守细胞24h文化华府LCCK-8解析法加到每口井中,并用37摄氏度注入4h细胞扩散用微版阅读器评价 450nm
2.6居地编程
野型和转基因细胞由密度为800个细胞/ell的6well板播种10天后,细胞固定4%仿冒并染上1%晶紫染色用33%乙酸冲刷,590纳米吸附用微板阅读器分析
2.7量化实时聚合链响应
完全RNA使用TRIZELZI试剂从骨肿瘤组织、反卡素软组织以及细胞线中分离出(Invitrogen,CA,USA)。CDNA使用PrimeScriptTMRT试剂包合成(ComWinBiotech,中国北京)。HCG9和MiR-34b-5p素数取自TermoFish科学素数序列显示于表一号.PCR使用荧光定量PCR系统SYBR绿色Mix(ComWin生物技术公司,中国北京)演化相对表达式水平使用2计算-ΔΔCtGAPDH和U6分别用作 mRNAs和MirNAs内部引用
2.8西布洛特
RIPA解析缓冲区(Beotime生物技术,上海中国)解析细胞或组织10分钟加冰蛋白质富集度使用BCAProteinAssay工具测定等量蛋白使用SDS-polyacli蛋白质转至硝化细胞膜薄膜阻塞在1xPBS缓冲区内含5%非脂肪牛奶和0.1%Tween-20辰族Act in(mouse, 1: 5000Cat#660091-IgProteintech,USA,H2A.X猫#ab26350abcam,UK,RAD51猫#ab133534abcam,UK),p53华府g/ml猫#ab26abcam,UK,bl2猫#12789-1-APProteintech,USA,Bax猫#505992IgProteintech,USA和Caspase3猫#19677-1-APProteintech 美国三次用PBST清洗后,薄膜用马拉底过氧化兹同化山羊反兔子(1:6000!猫#SA0001-2Proteintech 美国)或山羊反摩抗体猫#SA0001Proteintech,USA)1.5h室温1分钟加增染色素后(SperECL++,Advansta,USA),信号强度通过X光检测
2.9细胞循环分析
不同转基因组细胞收集并用PBS冲刷固化冰冷70% )乙醇24H再用PBS冲洗样本后再用RNaseA孵化华府g/mL30分钟样本与PI染色华府g/mL30分钟并进行流细胞分析以确定细胞循环分布
2.10维沃市tuori生成
雄性BALB/C裸鼠(6周大)从湖南SJA实验动物有限公司购买并安顿在第二雅医院动物院所有实验协议均获中南大学二院动物伦理委员会批准肿瘤构造 mNG/HOS单元二百分华府LPBS注入下层HCG9和MiR-34b-3p由GeneChem制造(上海,中国),在肿瘤细胞注入前通过侧尾静脉注入使用肿瘤体积测量4号、7号、11号、14号、17号、21号、24号和28号28天后外科大鼠化疗和肿瘤解剖以测量重量
2.11Ki67染色
肿瘤样本采集并固定在10%室温通宵样本逐步脱水乙醇并嵌入石蜡块5小节华府m收集、分解并补水抗原取回时用Tris缓冲 )15分钟使用蒸汽机样本以1%牛血清解析法(Sigma-Aldrich)阻塞并染上基67原生抗体(rabbit, 1:500!15580通宵4摄氏度与PBS清洗后,样本染色为goratishperoxidase猫#ab6721abcam) 二级抗体1:250浓度室温1小时染色样本安装并观察Zeis直立显微镜
2.12统计分析
所有数据均显示为 ,所有实验均独立重复至少三次学生馆 -单向ANOVA测试使用GreatPad Prism8.0对二组和三大组数据作比较 被认为具有统计意义
3级结果
3.1.HCG9基因表达式在Osteosorcoma组织与细胞中提升
并用Cox比例危险回归评估与osteoscoma的关联六大基因显示有统计意义表达式 )steosorosa组织对parcarcima组织并经过筛选,即MALAT1、HCG9、FAM99A、FAM87B、DLEU2和C8orf491(a))二级结构识别使用AnnoLnc注解完成,HCG9确定为本研究目标1(b))我们分析癌症细胞百科全书数据库中的HCG9基因表达法并发现HCG9基因表达法在各种癌症细胞线中提高1(c))因此,我们进一步验证 steoscoma和parcarcioma组织中从病人收集的HCG9基因表达qRT-PCR结果显示,HCG9基因表达方式与parcarcioma组织相比在骨骼肿瘤组织中显著提高调控度1(d))HCG9基因表达法还评估人体骨质细胞线hFOB1.19和ostosorcoma细胞线U2OS、MG-63和MNG/HOS,与HFOB1.19细胞相比,所有三种骨质细胞线均增强该表达法NNG/HOS显示高HCG9基因表达因此,MNNG/HOS单元被选作本研究中下列实验(图解)1(e))通过绘制卡普兰-Meier生存块并日志排序测试二分法HCG9基因表达法 被认为具有统计意义绘制接收器特征曲线并分析曲线下区域以验证HCG9基因表达式与预测相联性一号)AUC2年精确度为0.72kaplan-Meier图显示总体生存率低得多 )HCG9高表达式组与低表达式组比较1(f)表示HCG9与 steoscoma病人预测相关
(a)
(b)
(c)
d)
e)
f)
3.2HCG9介质Osteoscoma细胞扩散
下一步我们调查HCG9表达式如何影响 steosorcoma细胞扩散和吸附并用qRT-PCR验证HCG9基因表达HCG9基因表达式与野型控制细胞相比在sh-HCG9细胞中严重受限2(a))sh-HG9损耗MNG/HOS细胞的入侵和迁移能力入侵和迁移单元数比控制组少得多(图9)2(b)并2(c))HCG9还抑制MNG/HOS细胞扩散和聚变,CCK-8测定结果和聚变结果显示sh-HCG9组比控制组低得多扩散率和聚变计数2(d)并2(e))sh-HCG9诱导细胞抓捕,如细胞循环分析所示,G0/G1级得到显著增强,G2/M级在sh-HCG9组中受到极大抑制2(f))sh-HCG9还推广 proapoti蛋白表达式,包括Bax、Caspase-3和p532(g))结果表明HCG9耗竭严重抑制扩散和入侵、诱导细胞抓捕并推广骨科索马细胞非potocypheno
(a)
(b)
(c)
d)
e)
f)
g)
3cm3HCG9表达式与Osteosoma病人病理特征相关
我们分析HCG9表达式并筛选HCG9关联基因表达式 )使用KEG路径分析发现HCG9高表达式与osteoscoma相联2A)HCG9和临床病理特征之间的联系,如年龄、性别、相容性、等级和病理状态见补充图2B-2F.高HCG9表达式与癌症转移相关二维和等级类2E但不包括年龄等其他病理特征2B) and gender (Supplemental Fig.2C)并验证HCG9与临床病理特征之间的相互关系皮尔逊鸡嘴测试是为了评价 值.HCG9基因表达式与远程转移关系重大 )补充图二维和临床阶段 )补充图2E)结果表明HCG9基因表达方式对骨形相向转移和临床演进至关重要
3.4.HCG9负约束MiR-34b-3p
starBaseV2.0预测HCG9的潜在目标,MiR-34b-3p被确定为HCG9唯一目标总计104mRNA被定位为 mir-34b-3p的潜在目标并用图显示ceRNA网络3(a).染色体中目标mRNA分布由Cytoscape视觉化3(b))string分析http://string-db.org/mirNA目标基因测试 PPI网络由40节点和46边缘组成通过演化MCODE识别出两个模块3(c))模块1包括AHTF1、XPO1、ITGB3BPP和PPP1CC,它们是免疫响应相关基因,模块2包括CDH2、MET和NOCH2,它们与脱氧核糖核酸响应相关19号,20码..Geneontology(GO)、生物过程(BP)和KEGG浓缩分析显示高调基因丰富机构分治和细胞循环路径和下调基因丰富MiRNA癌症和Notch信号路径3)mir-34b-3p基因表达方式在骨类组织与细胞线中显著下调,而parcarcorma组织与escobl3(d)并3(e))HCG9显著增强MiR-34b-3p基因表达法表示HCG9负调MiR-34b-3p3(f))夸大MIR-34b-3p显性调控MIR-34b-3p表达式3(g))
(a)
(b)
(c)
d)
e)
f)
g)
mir-34b-3p在osteoscoma细胞扩散、迁移和入侵中的管理作用校验时,我们建立了HCG9和MiR-34b-3p高写MNNG/HOS单元HCG9过分表达显著增强24h文化内细胞扩散,并重表达HCG9和MiR-34b-3p部分反转效果4(a))HCG9增强聚居能力,同时并发HCG9和MiR-34b-3p部分减少聚居数,而HCG9群比(图9)4(b)并4(c))coover表达 mir-34b-3p还抑制MNG/HOS细胞入侵和迁移4(d)并4(e))细胞循环和potosis相关蛋白质也受到HCG9和MiR-34b-3p表达式的影响过分表达 HCG9鼓励细胞分解算法结果显示HCG9组G2/M循环中的细胞数比控制组高得多coover表达式HCG9和MiR-34b-3p废除这种效果4(f))RAD51是控制细胞循环并保护G2/M相位的密钥酶,而H2A.X保留细胞循环拦截高表达式HCG9推广RAD51表达式并抑制H2A.X表达式,表示HCG9诱导二分立并coover表达式MIR-34b-3p部分反转效果4(g))spopticals Bax、Caspase3和p53受HCG9高表达式阻塞,由MiR-34b-3p/HCG9共表达式反转反吸附蛋白Bcl-2受反射4(h))结果表明HCG9通过抑制MiR-34b-3p表达式增强并抑制骨超表达式MIR-34b-3p部分反转HCG9刺激超扩散
(a)
(b)
(c)
d)
e)
f)
g)
h)
3.5mir-34b-3p通过下调RAD51
下一步评估MiR-34b-3RAD51调控细胞循环和脱氧核糖核酸检验点,这些路径在我们临床骨类组织样本中大为调控3)iR-34b-3p和RAD51间的潜在绑定点使用星库预测5(a))iR-34b-3p超表达式和iR-34b-3p/RAD51共表达 steosorcoma细胞评价RAD51的参与MIR-34b-3p表达式在MIR-34b-3p超表达式组中大调高,MIR-34b-3p/RAD51共表达式组中部分反转5(b))CCK-8分析结果显示MIR-34b-3p比控制组高表达抑制细胞扩散,而MIR-34b-3p/RAD51共表达恢复了骨形细胞扩散5(c))RAD51在 mir-34b-3p中间细胞循环和 mir-34b-3p超表达式细胞循环拦截中也发挥了作用,因为它比控制组减少了G2/M相位数,而MiR-34b-3p/RAD51共表达恢复G2/M相位数5d)RAD51蛋白表达式因MIR-34b-3p超表达式而严重抑制并用MIR-34b-3p/RAD51共表达式恢复细胞循环抓取标记H2A.X反弹5(e))mi-R-34b-3p增强poptical蛋白表达式,包括Bax、Caspase-3和p53MIR-34b-3p/RAD51相容部分逆向效果5(f))结果表明,RAD51可成为MIR-34b-3p的潜在目标,并在HCG9/MiR-34b函数轴中发挥关键作用
(a)
(b)
(c)
d)
e)
f)
3.6.HCG9推广Osteosorma进化而MiR-34b-3p改善HCG9-模拟Osteosorama进化维沃市
我们评价HCG9和MiR-34b-3维沃使用裸鼠模型与肿瘤控制相比,HCG9高表达量显著汇总肿瘤生长量,并联表MIR-34b-3p部分减慢HCG9刺激肿瘤生长量,肿瘤体积和重量分析即为证明6(a)-6(c))免疫情学染色结果显示HCG9超表达群中基67阳性细胞过大,HCG9/MiR-34b-3p共表达群部分减少基67阳性细胞数6d表示 mir-34b-3p减轻HCG9刺激肿瘤攻击HCG9、MiR-34b-3p和RAD51 Gene表达式由qRT-PCR评价验证高表达效率HCG9超表达抑制Mir-34b-3p并推广RAD51,而协同表达HC9/MiR-34b-3p则反转效果6(e))西方blot结果进一步确认RAD51蛋白表达法受HCG9超表达法正面影响,由HCG9/MiR-34b-3p共表达法反转H2A.X蛋白表达式受反向冲击6(f))HCG9过量表达式诱导肿瘤组织反potocistic Bcl-2表达式,因为它抑制poptocistic Bax,Caspase-3和p53表达式并推广apotocistic Bcl-2表达式coover表达式HC9/MiR-34b-3p局部阻塞反吸附效果6(g))上头维沃检测结果确认HCG9重肿瘤增量和MiR-34b-3p反转效果
(a)
(b)
(c)
d)
e)
f)
g)
4级讨论
异位异位常与外科手术后骨形相联据报85%以上患骨科瘤的病人中都发生了异位移位[21号和转移性剧增预测骨科22号..最近的研究表明,IncRNA显示重要的调控功能以调控ostosorcoma23号..在当前研究中,我们开发出一种全基因组方法 连接IncRNAHCG9与 steoscoma的临床病理特征高HCG9与转移和重癌症等级相关生物细胞扩散、迁移和入侵响应HCG9基因表达式的改变使用生物信息技术,我们建立cERNA网络HCG9确定目标MIRNA据我们所知,这是首项研究报告HCG9基本调控作用及其骨架演进机制
受控内核基因表达法常见于肿瘤组织特别是骨类肿瘤学研究越来越多报告各种IncRNA对肿瘤组织与parcarcinosa组织表达方式不同九九..RNA微数组是一种强大的工具,可筛选肿瘤和parcarcroma组织异常表达式,为基因理疗提供可能的候选方24码..超过25,000 incRNAs用微数分析,并识别出千位骨科相关基因25码..微量肿瘤抑制和诱因内核作用举例说,MALAT1是最先识别的癌症相关基因之一,并常在osteosoma研究王等IncRNA MALAT1在骨肿瘤组织中表现得高并促发肿瘤转移26..H19、HULC、SNHG12和HOTAIR之类其他相容内核还显示其调控功能促进癌症细胞扩散、抑制吸附症和加重肿瘤增量27号-30码..由IncRNA微数组、MALAT1、HCG9、FAM99A、FAM87B、DLEU2和C8orf49筛选六大骨科基因MALAT1和DLEU2显示在前几期研究中促进骨质演化31号,32码..FAM99A、FAM87B和C8orf49研究中未曾报告骨类肿瘤研究,在其他癌症中很少报告由于资金和时间有限,我们没有深入研究它们未来研究中,我们将进一步判定它们是否与骨科科马相关HCG9已简要报告乳腺癌和胃癌三十三,34号但它从不骨科马分析CLE发现HCG9与各种癌症增量相关进一步生物信息分析显示高HCG9表达式与骨终于选择HCG9为研究对象额外验证方法包括比较临床骨类标本中的HCG9表达式与parcarcinoma组织,异常提高HCG9表达式在肿瘤样本中确认击倒HCG9显著抑制骨科细胞扩散、迁移和入侵,证明HCG9据我们所知 HCG9首次报告与 steosorcoma进程相关联,结果为steoscoma诊断和处理提供了新生物标志
incRNAs主要函数之一是作为cERNAs规范 mirNA表达式CERNAs是基因表达式后序调控新类,竞争MirNA/mRNA识别元素35码..使用生物信息技术建立ceRNA网络有助于说明对癌症演化主要信号路径可能产生的影响黄等剖析剖面软组织沙网相关联的ceRNAs基于癌症基因组地图集数据库,提供综合信息改善软组织沙网个人化管理36号..详细研究多片已识别骨形镜片轴试管内并维沃动物模型例举Zheng等incRNASNHG3竞争约束MIR-151a-3p规范RAB22A活动18号..谢等人TUG1可能绑定 mir-9-5p和MiR-212-3p以规范骨37号,38号透露二小片细节 整个拼图ceRNA网络在当前研究中MiR-34b-3p被星际基地预测为HCG9唯一潜在目标iR-34家庭常因各种癌症下降调控三十九包括卵巢癌和胰腺癌40码,41号..iR-34b-3p规范osercoma进程CERNA网络连接HCG9MIR-34b-3p 并解释受这些ncRNA影响的信号路径CERNA网络和路径分析定位4条脱氧核糖核酸相关路径,包括脱氧核酸损检点和单细胞循环,表示HC9/MiR-34b-3p轴在脱氧核糖核酸修复和细胞循环中发挥了重要作用iR-34b-3p发现MiR-34b-3p通过下调RAD51和HCG9负调MiR-34b-3正调RAD51促进并抑制骨科细胞扩散和吸附因时间和调查资金原因,我们没有执行双精度报告实验确实有必要通过双精度报告实验验证MIR-34b-3p和RAD51之间的关系计划未来研究验证
简言之,我们的数据证明HCG9负调MiR-34b-3p和悬浮肿瘤组织异常低表达miR-34b-3p支持我们的假设透析MiR-34b-3试管内超扩散、迁移和入侵维沃HCG9高表达度刺激肿瘤生长得到减慢,表示MiR-34b-3p在osteorcoma演程中可能起保护作用
5级结论
HCG9基因表达方式在骨形组织与细胞线中增加,高HCG9表达式特别与osteoscoma相容mir-34b-3p成为HCG9目标,RAD51成为MIR-34b-3p的潜在目标过分表达 HCG9推广骨科细胞扩散、迁移和入侵试管内并重肿瘤增量维沃.mir-34b-3p和HCG9相容缩放研究提供新治疗目标 帮助骨类生物处理临床实践
数据可用性
作者确认所有发现基础数据都可用所有相关数据都存于论文及其辅助信息文件内
道德验证
动物研究经实验动物中心、中南大学二合院审查批准2020408实验期间动物处置符合科技部2006年发布标准“实验动物处理指南意见”。二医院机构评审委员会批准了所有程序和组织采集协议
协议
病人在手术前都得到通知并签名书面同意
利益冲突
作者声明不存在利益冲突
作者贡献
论文编写者参与本研究的贡献如下:概念设计:Lu Wang提供学习素材:Shuangqing Li收集整理资料LinQi数据分析解析LinLing手稿写作:所有作者并最后批准手稿:所有作者所有作者阅读并批准最终手稿,我们已适当注意确保工作完整性
感知感知
感谢中南大学二合院提供一切支持这项工作得到了湖南省自然科学基金会的支持(No.N.N.N.2021J30939
补充素材
补充图1AROC绘图和BAUC分析HCG9基因表达率和生存率之间的关联补充图2A热图HCG9表达式和基因表达式HCG9表达式与B年龄、C性别、D相容性、E级和F状态相关补充图3GO、BP和KEG分析MRNA由HC9/MiR-34b-3p轴指令信号路径高山市补充素材)