新型复合杂合的PRKN汉族家庭的变异性，早期发作了帕金森病

抽象的

遗传因素被认为在帕金森病（PD）的发病机制中发挥着重要作用，特别是早起的PD。这PRKN基因是早期帕金森病的主要致病基因。其功能的细节仍不清楚。本研究鉴定了新化合物杂合子变异(p.T240K和p.L272R)PRKN一家汉族家庭的基因，早上发病PD。这种发现有助于PD的遗传诊断以及对的功能研究PRKN基因。

1.介绍

帕金森病(PD)是仅次于阿尔茨海默病的第二常见的神经退行性疾病[1］.帕金森主义，PD的核心临床特征定义为缓慢进步的Bradykinesia与休息震颤或刚性相结合[2］.PD的病因仍然是神秘的，而环境和遗传因素被认为参与其中[3.］.目前，已有23个致病位点和19个基因被确认为PD，并记录在人孟德尔遗传在线(OMIM)中[4］.虽然PD主要影响50岁以上的早期发病PD（EOPD）患者，但在40岁之前出现的运动障碍症状出现，占全世界所有PD患者的3-5％[5］.EOPD的主要遗传类型为常染色体隐性幼年型帕金森病(AR-JP, OMIM 600116)，由parkin RBR E3泛素蛋白连接酶基因(PRKN）[6］.它有帕金森病的症状，但可能是不同于晚发散发性帕金森病的疾病实体。这是由于起病时肌张力障碍更多，左旋多巴反应更好，疾病进展更慢，睡眠受益，非运动症状和路易体频率更低[7- - - - - -9］.

该基因编码的parkin蛋白可泛素化大量线粒体外膜蛋白，导致受损线粒体自噬PRKN突变导致线粒体质量控制缺陷和神经元死亡[10.］.由于其在各种肿瘤中的复杂活化机制和抑制作用，Parkin蛋白已被强烈研究[11.，12.］.本研究报道了一种新的复合杂合子变异PRKN与EOPD的家庭中的基因（图1）.这一发现扩展了PRKN-相关的PD基因谱，可能为研究parkin蛋白的结构和功能提供新的见解。

2.材料和方法

来自中国山东省的韩文家庭，招聘了中国山东省（图1(一)）.先证者、她的兄弟和儿子由两位经验丰富的神经科医生检查和诊断。200名40岁以上、无血缘关系的健康汉族人作为对照组。本研究得到了中南大学湘雅三医院机构审查委员会的批准。在获得书面知情同意后，采集所有参与者的外周静脉血样本。从先证者(II: 2)中分离的gDNA被pd相关基因面板捕获。随后，使用Illumina HiSeq X-ten平台(Illumina Inc.， USA)进行配对端测序。根据单核苷酸多态性数据库、1000基因组计划和外显子组聚合联盟数据库筛选所有可能的变异。编码插入，剪接位点的潜在变化，以及小等位基因频率<10的外显子中的非同义单核苷酸变异⁻³被认为是致病候选者。Sanger测序验证候选变异使用ABI3500测序仪(Applied Biosystems Inc.， USA) [13.］.筛选不耐受(SIFT)和组合注释依赖耗尽(CADD)预测变异的潜在致病作用。基本局部比对搜索工具分析氨基酸序列的保守性。靶向测序和Sanger测序的方法在补充材料中有详细介绍。

3.结果

3．1.临床特征

证据（II：2）发作的年龄是32年。初始症状在右臂的慢速和休息震颤，并且一年后似乎出现了紧张。这些电机症状在六年后慢慢进展并蔓延到右腿和对侧肢体。Levodopa治疗显着提高了35岁时的第一次检查的电机症状，但没有进行详细的评估。在她的最新评估，在39岁时，临床建立的PD在突出的Bradykinesia症状和其他与PD相关的症状的基础上被诊断出来，包括休息震颤，刚性，面部掩蔽，麻木，难以入睡，嗅觉障碍，便秘，轻度认知障碍，抑郁和焦虑。她的MDS统一帕金森的疾病评级秤电机得分为9（开启）/ 14（OFF），迷你精神状态考试评分为22.颅骨CT和MRI结果，血液和尿液铜水平，刺激性均为正常。在她的儿子（iii：1）或哥哥（II：1）中没有发现任何运动障碍或其他神经系统障碍。

3.2。分子的发现

在目标捕获测序和过滤后，仅P.T240K（C.719C> A，RS137853054）和P.L272R（C.815T> G）变体PRKN基因被认为是已知的单基因pd致病基因的候选致病基因。随后的Sanger测序在先证者中证实了这两点(图)1 (b)和1 (c)）.在她的儿子(III: 1)中发现p.T240K变异。这两种变异在她的哥哥(II: 1)和200名正常对照组中均缺失。在基因组聚合数据库(gnomAD, 7.954 × 10)中，p.T240K的杂合态频率极低⁻⁶）.SIFT和CADD预测C.719C> A（P.T240K）变体作为破坏性（表1）.p.L272R变异尚未在gnomAD中报道，在SIFT和CADD分析中也有破坏性的预测(表)2）.多序列比对显示，从果蝇到人类，位于272位的亮氨酸在系统进化上是保守的(图)1 (e)）.这些数据表明，化合物杂合变体，P.T240K和P.L272R可能导致在这个家庭中的eopd。

4。讨论

parkin蛋白是RING-between-RING (RBR)家族的一个465氨基酸E3泛素连接酶，它可以催化泛素从E2结合酶转移到底物蛋白上[10.］.近年来，大量的研究试图通过研究parkin蛋白的结构与功能之间的关系在体外和动物实验。蛋白质结构变化效果的最直接和令人信服的证据仍然是患者检测到的突变，特别是畸形突变。大约25％的人PRKNRING1结构域被认为是E2结合酶的结合位点，由于它与ser65磷酸化的泛素和UbL结构域相互作用，因此对parkin的激活非常重要(图)2）[10.，14.，15.，21.- - - - - -29.］.parkin的详细分子结构尚不清楚，这导致了几种不同的激活和催化模型[30.］.

在本研究中，先证者存在三种主要的运动症状和多种非运动症状，提示临床上确定的EOPD和广泛的神经系统损害。两个具有潜在致病性的错义突变体(p.T240K和p.L272R)位于RING1结构域，此前在PD患者中未见报道。虽然240位苏氨酸的序列保守性低于272位亮氨酸(图)1 (d)和1 (e))，已报道至少16例PD患者PRKNp.T240M、p.T240R或p.T240A突变体在纯合或复合杂合状态下(见表1)1）[6，14.- - - - - -21.］.该氨基酸位于Ring1结构域的第一个Zn结合环中，被认为是Parkin的E2结合位点[31.］.p.T240R突变被发现改变了E2结合界面，破坏了parkin蛋白的自biquination activation，导致EOPD [31.，32.］.第一个α.UbL结构域通过疏水作用与RING1结构域相邻，阻断E2通路[10.，33.］.已经记录了另外三种麦克信（P.L272I，P.L272V和P.L272F）和第272d密码子中的一个同义变体。然而，对于这四种变体没有报道致病的证据，这可能是由于产生群体的低等位基因频率和疏水性的保存（表2）.P.L272R导致物质亲水的交替，更可能破坏蛋白质折叠并影响其功能，特别是在稳定在诸如Parkin等多种疏水性相互作用的紧凑蛋白质（表2）[34.，35.］.研究p.L272R突变体引起的结构变化可能有助于理解parkin域相互作用及其潜在功能。需要更多的证据，包括分离信息和功能研究，将两种变体分类为致病或可能致病的变体，根据美国医学遗传学和基因组学变异解释指南[36.］.

总之，新型化合物的杂合子变异PRKN基因p.T240K和p.L272R在一个临床确诊的EOPD家族中被鉴定为可能的遗传原因。这两种错义变体都导致了RING1结构域的氨基酸变化。这一发现具有潜在的研究价值PRKN基因和帕金森病的遗传诊断。需要进一步的研究来阐明它们的致病性，并可能提供更深入的了解详细的功能作用。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

披露

范宽和胡鹏志应该被认为是共同第一作者。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

国家自然科学基金项目(no . 81873686, no . 81670216, no . 81800219, no . 30970990);湖南省自然科学基金项目(no . 2019JJ50927, no . 2018JJ2660, no . 2018JJ2556);湖南省卫生和计划生育委员会科研项目(B20180760和B20180729)，贵州省科技基金(20191196)，湖南省研究生创新基金(CX20190075)

补充材料

本文详细介绍了靶向测序和Sanger测序的方法。（补充材料）

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