抽象性

OSTEOSOMA是骨中最常见的初级恶性对感化疗反应差的病人患逆预测风险较高分子基础仍然不明朗八大开切样本中MiRNA表达式检测MiRNAs感知感化疗响应并可能用于风险分层理疗样本取自四位低效死尸(Huvos I/II)和四位高效死尸(Huvos III/IV)发现六枚MiRNAs,包括MiR-125b和MiR-100差分表达 >2倍 病人对治疗反应不力 ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////差预测与丰度MiR-125b和MiR-100之间的联系得到了另外20名骨科肿瘤病人量化逆序转录酶聚合链响应的确认。mir-125b和mir-100三条骨牌细胞线的过分表达增强细胞扩散、入侵和抗乳胶化药,如合散药、二叉素和环白素高清晰度MiR-125b阻塞化疗代理器诱发potosis开机生物检测例行诊断osteorsoma,这些样本中MiR-125b和MiR-100级可用作风险分层法基础

开工导 言

Osteosorcoma骨中最常见的初级恶性并是儿童和青少年癌症死亡的主因一号,2..摄取率15-20%是在1970年代单靠对局部骨科瘤病人的外科实现的高用量多试剂化疗法和感化疗法引进后,这些率大幅提高至80%3,4..上演化疗下级肿瘤和通过抑制微转移肿瘤和下降肿瘤血管促进完全剖析感化法响应按Huvos定级系统进行组织学评价5基于肿瘤坏死程度 外科切分解组织90%肿瘤坏死病人入院化疗被认为是好响应者,所有其他人被认为是差响应者2..值得注意的是,对感应化疗的语理响应是最可靠的预测性因素,除诊断时转移外[6-15..因此,预测感化疗响应可潜在用于确定最适当的处理法16..

Hivos定级广受使用,但化疗后获取,因此不预测性而在另一方面,临床实用生物标志尚未识别,尽管骨形镜这使病人根据抗药性风险有效分层并可能防止治疗方面进一步创新因此,必须理解分子基础化学开发更有效的治疗方法

OSTEOSOMA遗传异同 病人间,跨肿瘤间和肿瘤内17,18号..steosorcomakary19号..因此,综合omics方法多级测量分子事件可能识别出新分子机制对处理产生抗药性复杂机制可促进药理学,但仍可能发现重要的生物洞见

此前,我们调查了开活性样本剖面图,这些样本取自化疗前骨科2类并识别二叉毒素2类为新奇预测生物标志,响应化疗Ifosfamide、doxoricin和cislatin20码..后发现PRDX2预测用不同组合药对感化疗的反应21号..开放生物检测例行诊断骨类生物标志,在此过程采集样本中测量的预测生物标志可能证明对临床环境有用。

微核素小非编码RNA 21-25核素长控制生长、开发并通过调节基因表达后序人类基因组编码超过1000MERNAs22号规范千人基因23号,24码..steosorcoss全球表达式25码,26进取27号,28码响应处理29,30码并预测31号..但这些MiRNAs的临床意义尚未确定

研究中,我们探索了MiRNAs表达法在预测对oscoma病人新jivant化疗响应方面是否有用的可能性我们分析MiRNA化疗前获取的冷冻组织样本表达式发现MiR-125b和MiR-100的丰富表达方式与化疗响应差大相联独立样本集使用qRT-PCR验证结果并验证MiRNA的功能意义试管内解析

二叉素材方法

2.1.病人和临床信息

冷冻临床样本取自日本国家癌症中心医院样本取自8名病人一号)在2009至2011年间诊断并按标准处理协议处理的dhotrexate、doxoricin和cisplatin32码..术前化疗响应由病理学家根据Huvos定级系统评估2万事通不到10%肿瘤细胞可行时,病人被定义为响应者,如果不是响应者,则被视为不响应者(耐药性)。样本采集时用液氮并存储到-80摄氏度

独立组20名病人2并使用化疗前公开生物采样收集的定型补丁标本验证结果从1990年到2008年诊断出这些病人九位病人抗化疗,11位病人对化疗敏感所有病人从0.5年监测到11.1年,平均7.7年七位病人持续无病,七位病人因此病死亡,六位病人与骨科马一起生活

所有病人都获得书面知情同意,研究得到了国家癌症中心伦理委员会的批准。

2.2.RNA提取式MIRNA和MRNA数组

冷冻组织使用多波段电击器在液氮下粉化(大阪Yasui Kikai全RNA使用MiRNeaserMiniKit提取(荷兰VenloQiagen市)。定型补丁样本分解为10华府m和总RNA使用MiRNeasyFFPE Kit(Qiagen)从数片中提取

MIRNA表达式剖面图通过将全RNA混合到Agleent human mirNA微数组V3获取(02182788x15Kv120Agilent技术公司Santa ClaraCA)混合微数组扫描DNA微数组扫描器(Agilent G2565BA)并预设协议和设置mirNA表达式用GenesspringGX软件分析mirNAs表达式增减大于1.5倍时被视为有差别表达式 置身于无依无靠 测试

mRNA表达式剖面图通过将全RNA混合成SurePrint G3人类GE微数体获取(8x60KVER3.0,Agilent技术公司Santa ClaraCA)脱氧核糖核酸微数组数据由生物导体agilp包分析http://bioconductor.org/packages/agilp/)探针选择时两种样本强度大不相同(1.5倍以上变化)。

2.3iR-100和iR-125b独立样本验证

mir-100和MiR-125b从形式内包装样本中量化反转矩数聚合物链反应变(qRT-PCR)放大i-miR-100和hsa-miR-125b(应用生物系统)和TaqmanMicroRNA逆序装箱目标MIRNAs在95摄氏度时超过45周期加速10秒,60摄氏度时退火10秒,65摄氏度时扩展10秒,后在95摄氏度时初始退火10分PCR用7300实时PCR系统(Applii生物系统)用96well盘拷贝完成,MiRNA表达式与小核RNARNU6B(Applii生物系统)规范化

2.4.细胞培养转换

微信细胞线NNG-HOS143B和MG63-American类型文化集合简言之,细胞在37摄氏度培养₂机房使用10%胎儿牛血清、1mol/L纳回旋酸、非必备氨酸和2mol/L电池转介使用DharmaFECT转录试剂MiRNA25NM负控MiRR-100MIR-100MIR-Bonac公司Fukoka日本FukokaMiR-125

2.5细胞扩散剖析

细胞扩散用标准MTS解析测量简言之,细胞3x10播种³电池/井板96水装百华府L文化介质,夜间生长并转介MiRNAs转口细胞媒体转口后换为新介质A24h细胞可行性后由Cell计数KT-8判定(Dojindo,Kumamoto,Japan)算法中WST-8因可生存细胞去氢气活动而减少生成复式染色,该染色在组织培养介质中可溶解化,并因吸附450nm[三十三..Framazan染色量与可行细胞数成正比三口井每次检查,实验独立重复三次结果报告为平均++SD统计意义测试 测试

2.6细胞入侵解析

细胞入侵评估使用BD生物coatTM入侵机简言之,用MiR-125b或MiR-100传输24H⁵单元格500华府L免血清介质下院介质含有10%子牛血清作为化工源细胞穿透Mitrigel嵌入膜与Diff-Quick相染并计数实验独立三次,统计意义由判定 测试

2.7Poptosis解析

细胞移植描述有25NM负控MirNA、Mir-100和MiR-125b并24小时处理蛋白质提取出并用西线染色测量potosis相关蛋白

2.8蛋白提取西布洛丁

冷冻组织用液氮粉末并用多波段电击器重新悬浮到6ml/Lea、2ml/Lthiourea、3%CHAPS和1%TritonX-100超轨迹经离心清除 时间为15000分30分嵌入式细胞用PBS清洗,10%TCA固定30分钟,并在同一缓冲区解析30分钟超导体离心30分钟后采集

Proteins用SDS-polyaclime gels分离并转归硝化细胞膜Tris缓冲saline和Tween20屏蔽1H后补充5%非脂肪牛奶,4摄氏度对膜隔夜孵化初级抗体Bak1(monoclonal,1:250BL)、PARP(1:1000BD)、Caspase-3(1:1 000BD)、Caspase-9(1:1 000BBL)、Caspase-2(1:1 000BD)、BMF(polyclonal,1:1 000BBL)、PUMA(monoclonal,1:1 000BD)、BlCL-2(monclonal,1500BD)、PP2A-CL解析α1:1000BD,MCL-1辰族Actin(1:1000BD)薄膜随后用TBS-T广度洗刷并贴上马铃薯复用二级反用标签(1:1 000,GE)或abbitIgG(1:2000GE)TBS-T额外冲刷后,ECL-PrimeKit可视化抗原综合体

2.9mirNA转换为Osteosoma细胞

编程RNA样本时,MG63细胞用DharmaFECT转录试剂转介25NM负控制MirNA、MiR-100和MiR-125细胞移植后72小时采集mRNA转基因细胞表情剖面图供使用上文提到的DNA微数组全局mRNA表达式研究使用

3级结果

我们分析全局MiRNA表达式 八大封存诊断开放生物检验标本临床和病理数据汇总表一号.mirNA表达式研究所包括的肿瘤有组织骨架学并发源于股骨或tibia自前一研究显示,对化疗响应与语法有显著关联34号使用相似语学解剖背景样本研究中省略语学偏差10%以下可生存肿瘤细胞的病人被视为良好的响应者,根据Huvos定级系统,所有其他人均被视为差响应者表达式剖析六兆赫 好响应者差响应者间1(a)补充材料表1在线提供http://dx.doi.org/10.1155/2016/1390571)其中MIRNAs483-3p、100、124、125b和127-3p在差响应器中表现得更多,而MIR-887表达法则受抑制临床或病理因素显然与差分表达式无关验证结果时,MiRNA用同8样本qRT-PCR放大检验确认大相径庭 miR-125b和MiR-100表达式差响应器1(b)并1(c)mirNAs124、127-3p、483-3p和8871(d)-1(g))由qRT-PCR测量的表达层次显示与微数组数据相同总趋势

深入调查这些观察结果时,我们用20个形式化联想开机切片样本测量qRT-PCR表达式 )肿瘤组织验证使用异类内含骨质变异性、复发性或纤维性肿瘤,原发地包括tibia、femur或ium通过探索这些多式肿瘤样本,我们旨在证明MiRs多功能性预测新元化疗响应并发现MiR-125b和MiR-100表示高得多水平 差响应者2(a)并2(b))接收器操作特征曲线下有0.909和0.899区域,MiR-125b和MiR-100分别为MiR-125b和MiR-100 ,图解2(c)并2(d))

参照这些结果,我们描述MiR-125b和MiR-100在骨形细胞中的功能意义细胞扩散分析显示MiR-125b和MiR-100可显著提高MNG/HOS、143B和MG63的生长3(a)-3(c))此外,我们发现MiR-125b促发MNG/HOS和143B细胞入侵,而MiR-100增强所有三大细胞线的细胞入侵性4(a)并4(b))观察结果显示MiR-125b和MiR-100过分表达对肿瘤生成有重大影响。

mir-125b和MiR-100对化疗药效的影响mir-125b高清晰阻塞所有细胞中多异性、多异性素和环白素的细胞毒理作用(补充图1补充表3)。mir-100还阻塞细胞毒性,但NDNG/HOS细胞中的 doxoricin除外(补充图1补充表3)。后来,我们专注于MiR-125b, 因为它能阻塞所有细胞内所有化疗药

假设MiR-125b抑制optosis驱动肿瘤进化疗和抗化疗iR-125b过分表达明显减少potosis蛋白表达方式,包括p53、Caspase-2、MCL-1、PUMA和PP2A催化 补充图2(A)iR-125b阻塞Mithetrexate、doxoricin和cisplatin诱导Bak1和cleepPARP表达式(补充图2(B))。夸大MIR-100导致CTDSPL和Rb表达式下降(补充图2(C))。这些结果与我们的假设一致MiR-125b通过抑制吸附症可能有助于抗药性

iR-100和iR-125b效果探索时,我们检视MRNA转美MR-100或MR-125b后的全球表达式mir-100和MiR-125b转导差分表达法分别为35和88个基因(补充表4和5)。16mRNA常用上下调控MiR-100和MiR-125b3)

4级讨论

steosorosa上报数个生物标志,包括P-glycoprotein15和PRDX2相关联20码,21号..反之,Borys等[35码s报告p16与治疗响应相关虽然MiR-100和MiR-125b研究看似大有希望,但没有足够证据支持实际使用需要进行广泛的验证研究以确定这些生物标志应用前的预测实用性

mir-100和mir-125b在治疗前组织中的丰度表示预测新元化疗响应差值得注意的是, mir-100和MiR-125b表达法被发现骨类组织比邻近健康组织表达法低[36号,37号..研究相邻组织表达方式是否以某种方式与临床参数和病理参数相关时 可能信息化iR-100和iR-125b优于先前报告的其他预测生物标志ROC曲线下区域PRDX2报告为0.90 )[20码,21号..MIR-100和MIR-125b预测性能均等同PRDX2PRDX2表达式用西方染色测量,这种方法不容易自动化相形之下,MiR-100和MiR-125b表达级由qRT-PCR测量,很容易自动化iR-100和iR-125b的实际实用性应进一步探索

MiR-100和MiR-125b报告对浮游细胞扩散的影响引起争议黄等[36号mir-100抑制Sos-2和MG63细胞扩散,反SenseRNA对Mir-100的反效果对比之下,我们发现MiR-100和MiR-125b刺激MNB/HOS、143B和MG63细胞扩散3)差异的可能解释是使用不同解析测量细胞扩散三十三..steosorcoma杂交恶性学,为建立分子化武机制,我们可能需要探索多行osorcoma细胞线

mRNAs表达式常因 mir-100和 mir-125b转包表达servin信息类型规范2同族5试管内并维沃非小型细胞肺癌中Cis-Diminediclaptinum、5-Flyuracil或blumycin处理38号..异常监管SIRT5报告有各种恶性举例说,在乳腺癌方面,SIRT5表达式与肿瘤位置、等级和表达式有显著关系三十九..由MIRNAs规范的SIRT5异常表达servin家族基因在致癌和癌症演进中发挥重要作用40码并值得挑战调查 servtuins在osteosarcomas的调控和功能

下一个挑战就是建立MiR-100和MiR-125b的临床实用性由于本研究案例有限,在临床应用前可能需要更多验证研究预测新元化疗反应差可能避免使用耗时但最终无效的处理方法,从而防止病人经历不必要的副作用可惜没有替代治疗策略即时外科剖析预测化学风险可改善某些病人的临床结果识别抗化疗病人还可能证明将其纳入新药抗癌剂临床试验有理归根结底,我们也许能识别新的治疗目标,描述MiR-100和MiR-125b表达式相关性的分子基础和对Neadjivant化疗的反应

mir-100和mir-125b表达层转移肿瘤引人入胜最近Berlanga等将原生osteosarcomas与肺相向osteosarcomas并识别26 mirNAs41号..mir-100和mir-125b研究中虽然没有识别出,但值得用双向初级和异向肿瘤组织检查对化疗有不同响应的病人的表达方式mir-100表达式水平和肿瘤复发关系也值得探索Sanchez-Diaz等先前曾报告与肿瘤复发相关联的 mirNAs身份42号..可能因为他们专注于小儿骨科、MiR-100和MiR-125b未被识别为与肿瘤复发相关联新珠凡化疗响应与有利预测相关联,MiR-100表达式和MiR-125b表示式可能与osteorosa未来研究应探讨这一假设

简言之,MiR-100和MiR-125b预处理与差化疗响应关系重大,是指导处理决策的有前途生物标志

披露

Daisuke Kubota目前地址为Juntendo大学医学院正术系,日本东京现地址NobuyoshiKosaka为牛津大学Zoology系,联合王国牛津Tomohiro Fujiwara目前地址为Orthopaed外科院,Okama大学医学、牙医学和药学研究生院,日本Kyama

竞技兴趣

作者声明他们没有利益冲突

感知感知

这项研究得到了日本医学研发局、国家癌症中心开发基金(26-A-3)和Grant-in援助科学研究25871161的支持。

补充素材